[发明专利]大肠杆菌S-甲酰谷胱甘肽水解酶的原核表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达大肠杆菌S-甲酰谷胱甘肽水解酶蛋白(FGH)的原核表达载体pET32a-FGH及其在FGH蛋白的原核表达和FGH包涵体蛋白制备中的应用。

背景技术

甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6.65倍，为0.492mg/m³，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。

甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性，长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。

相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物(VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种：一是使用环保材料；二是开窗通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994，Plant Physiol.104：1301-1309)。

为了防止甲醛对生物体致死和突变的影响，生物体已经进化了一些修复机制。甲醛的脱毒可以通过甲醛歧化酶、甲酸甲酯合成酶、或谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶来实现。

谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶修复系统广泛存在于很多原核生物和真核生物中(Gonzalez等，The Journal of Biological Chemistry，2006，281：14514-14522)。在依赖谷胱甘肽的甲醛代谢途径中，HCHO首先和谷光甘肽(GSH)形成加合物-羟甲基谷光甘肽(HM-GSH)，然后由谷光甘肽依赖型的甲醛脱氢酶(FADLH)催化形成甲酰基谷光甘肽(Formyl-GSH)，再被S-甲酰谷胱甘肽水解酶(FGH)水解为HCOOH，HCOOH最后被甲酸脱氢酶(FDH)氧化为CO₂和H2O(Hanson and Roje，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.2001，52：119-37)。

在大肠杆菌中frmA和frmB分别编码S-羟甲基谷胱甘肽脱氢酶和S-甲酰谷胱甘肽水解酶，FrmA和FrmB的表达受甲醛的诱导，且它们的表达比非诱导的细胞高20-100倍，这两个蛋白质都与体内甲醛的脱毒有关(Gonzalez等，The Journal ofBiological Chemistry，2006，281：14514-14522)。S-甲酰谷胱甘肽是甲醛在谷胱甘肽依赖脱毒途径中的一个中间产物，S-甲酰谷胱甘肽水解酶对S-甲酰谷胱甘肽具有很高的水解酶活性。大肠杆菌有两个具有活性的S-甲酰谷胱甘肽水解酶，他们是诱导型FrmB和组成型YeiG。这两种酶是异位的丝氨酸水解酶，具有水解S-甲酰谷胱甘肽的能力。由于FrmB编码的FGH对S-甲酰谷胱甘肽的水解酶活性很高(比YeiG编码的FGH高5倍)，所以在大肠杆菌中这种蛋白质有可能是主要的S-甲酰谷胱甘肽水解酶(Gonzalez等，The Journal of BiologicalChemistry，2006，281：14514-14522)。这说明FrmB编码的FGH是甲醛脱毒谷胱甘肽依赖途径的一个关键酶，这个酶可能也存在于很多植物谷胱甘肽依赖甲醛代谢途径中，因此这个酶的过量表达可以用于提高植物吸收和代谢甲醛能力的遗传操作。FGH蛋白特异性抗体是检测植物中FGH蛋白表达水平的有效工具。但现有研究还未有制备FGH抗体的报道。

发明内容：