[发明专利]高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒

权利要求书

1.一种高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，该试剂盒包括阳性对照、阴性对照、高粱花叶病毒多克隆抗体、高粱花叶病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，将阳性对照、阴性对照、高粱花叶病毒多克隆抗体、高粱花叶病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装得到试剂盒，所说的其它材料和药品包括包被缓冲液、PBST，病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，其特征在于高粱花叶病毒多克隆抗体在分离提纯高粱花叶病毒甘蔗分离物后，通过家兔免疫分离血清得到；高粱花叶病毒单克隆抗体在分离提纯高粱花叶病毒甘蔗分离物后，通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到；

所述的高粱花叶病毒通过采集含有高粱花叶病毒的甘蔗病株样品、经检测提纯得到；

采集检测过程为：在田间采集甘蔗病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量高粱花叶病毒，且只含有该病毒，样品采集后放入-80℃冰箱中保存备用；

高粱花叶病毒提纯的过程为：

感病甘蔗叶片，加PB抽提缓冲液，病叶与PB抽提缓冲液的重量体积比为1∶2，单位为克/毫升；电动搅拌机充分匀浆，双层纱布过滤；滤液中加入20％氯仿，在4℃搅拌15min；在8000g离心力、4℃下离心15min；弃沉淀，收集上清液；上清液中加入其体积5％重量的工业级纤维素酶，单位为克/毫升，37℃搅拌温育45min；在8000g离心力、4℃下离心15min；弃沉淀，收集上清液；上清液中加入6％PEG和3％NaCl，搅拌溶解后4℃静置4h或过夜；在10000g离心力、4℃下离心20min；弃上清液，沉淀用PB抽提缓冲液充分悬浮洗涤；在10000g离心力、4℃下离心20min；收集上清液；沉淀重新悬浮离心3遍；合并上清液，在80000g离心力、4℃下离心120min；弃上清液，沉淀用PB抽提缓冲液充分悬浮洗涤；在10000g离心力、4℃下离心20min；收集上清液；沉淀重新悬浮离心3遍；合并上清液，上清液即为病毒粗提纯液；清液加入加有10％-50％的蔗糖垫的离心管中，在80000g离心力、4℃下，水平离心120min；收集含有病毒层液体，在80000g离心力、4℃下离心120min；弃上清液，沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液充分悬浮洗涤；沉淀悬浮液即为病毒精提纯液；

所述的高粱花叶病毒多克隆抗体由以下过程制备得到：

1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯的高粱花叶病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃下保存；

2)进行免疫注射，将1ml提纯的高粱花叶病毒加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，将1ml提纯的高粱花叶病毒加1ml福氏完全佐剂，充分混合，家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，将1ml提纯的高粱花叶病毒耳静脉注射；一周后，取2ml提纯的高粱花叶病毒，耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，得高粱花叶病毒多克隆抗体；

所述的高粱花叶病毒单克隆抗体由以下过程制备得到：

1)选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将高粱花叶病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃下保存；

2)高粱花叶病毒单克隆抗体制备，提纯的高粱花叶病毒免疫雌性小鼠，经细胞融合、ELISA筛选、克隆，生产和贮存，单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥，得高粱花叶病毒单克隆抗体。