[发明专利]高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

高粱花叶病毒Sorghum mosaic virus，SrMV，属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属成员，病毒粒子长750nm，单链正义RNA，外壳蛋白分子量为36kDa，在感病组织内形成风轮状内涵体。由高粱花叶病毒引起的甘蔗花叶病在我国浙江、云南发生普遍且危害严重。感病植株节间缩短、含糖量下降、品质退化。该病毒可随种蔗和蚜虫传播，爆发流行的风险较高，是甘蔗生产上为害较大的病毒病害之一。因此需要建立快速、准确、灵敏的检测方法。目前报道高粱花叶病毒的检测主要以电镜观察、RT-PCR检测为主，这些方法存在特异性、准确率不高等不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，利用提纯的高粱花叶病毒制备高效价、高特异性、高灵敏度的多克隆抗体和单克隆抗体建立的TAS-ELISA检测试剂盒，具有准确性强、灵敏度高和规模化生产等优点，克服了上述现有技术存在的缺点。

本发明的另一目的在于提供一种高粱花叶病毒三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS--ELISA)检测试剂盒的制备方法。

本发明提出的这种试剂盒包括阳性对照、阴性对照、高粱花叶病毒多克隆抗体、高粱花叶病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，将阳性对照、阴性对照、高粱花叶病毒多克隆抗体、高粱花叶病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装，得到试剂盒，其它材料和药品包括包被缓冲液、PBST，病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，其特征在于所述的高粱花叶病毒多克隆抗体在分离提纯高粱花叶病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的高粱花叶病毒单克隆抗体在分离提纯高粱花叶病毒甘蔗分离物后，通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。

上述的高粱花叶病毒通过采集含有高粱花叶病毒的甘蔗病株样品、经检测提纯得到；

上述的病毒抽提缓冲液的制备：在田间采集病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量高粱花叶病毒且只含有该病毒，样品采集后放入-80℃冰箱中保存备用；所得抽提缓冲液为0.2M的PBS，其pH7.4、含0.5％巯基乙醇，0.01M EDTA。

病毒精提纯液的提纯：

感病甘蔗叶片，加PB抽提缓冲液，病叶与PB抽提缓冲液的重量体积比为1∶2，单位为克/毫升；电动搅拌机充分匀浆，双层纱布过滤；滤液中加入20％氯仿，4℃，搅拌15min；在8000g离心力、4℃下，离心15min；弃沉淀，收集上清液。上清液中加入其体积5％重量的工业级纤维素酶，单位为克/毫升，37℃搅拌温育45min；在8000g离心力、4℃下，离心15min；弃沉淀，收集上清液。上清液中加入6％PEG，3％NaCl，搅拌溶解后4℃静置4h或过夜；在10000g离心力、4℃下，离心20min；弃上清液，沉淀用PB抽提缓冲液充分悬浮洗涤；在10000g离心力、4℃下，离心20min；收集上清液；沉淀重新悬浮离心3遍；合并上清液，在80000g离心力、4℃下，离心120min；弃上清液，沉淀用PB抽提缓冲液充分悬浮洗涤；在10000g离心力、4℃下，离心20min；收集上清液；沉淀重新悬浮离心3遍；合并上清液，上清液即为病毒粗提纯液；清液加入加有10％-50％的蔗糖垫的离心管中，在80000g离心力、4℃下，水平离心120min；收集含有病毒层液体，在80000g离心力、4℃下，离心120min；弃上清液，沉淀用0.02mol/L磷酸盐缓冲液充分悬浮洗涤；沉淀悬浮液即为病毒精提纯液。

该病毒精提纯液电镜下观察含较大量的高粱花叶病毒病毒粒子，未见杂质；紫外分光光度仪上测定A₂₆₀/A₂₈₀＝0.869。经紫外分光光度仪检测，200nm-400nm全波长扫描图显示为典型病毒扫描图，提纯样品稀释10倍液中A₂₆₀＝0.8539，A₂₈₀＝0.5457，A₂₆₀/A₂₈₀＝1.5678，病毒浓度＝A₂₈₀×1.5-A₂₆₀×0.75＝1.78125mg/ml。

高粱花叶病毒多克隆抗体的制备步骤：

1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物，将高粱花叶病毒精提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃下保存：