[发明专利]环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及细菌的快速检测技术，具体的说是涉及一种环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CPn)是1989年新定名和分类的第三种衣原体，是引起人类急性呼吸道感染的重要致病原，临床上不仅可引起呼吸系统感染性疾病(肺炎、支气管炎、鼻窦炎和咽炎)，而且在心血管疾病、哮喘、结节病患者中也发现较高的抗体水平，近年又发现Cpn与AS有密切相关。

目前，肺炎衣原体的病原学检查主要有以下方法，一是从气管或鼻咽吸取物做细胞培养，此培养法，由于肺炎衣原体只能在活细胞内生长繁殖，分离培养方法复杂，所需时间长，对操作人员要求高，而且敏感性不高，不便于临床快速诊断。二是用荧光结合的肺炎衣原体特异性单克隆抗体来鉴定细胞培养中的肺炎衣原体，值得注意的是，荧光显微镜的质量及操作熟练程度会影响免疫荧光试验的结果。三是用PCR检测标本中肺炎衣原体DNA，此方法检测程序相对复杂且对实验室的环境要求较高，此方法容易产生假阳性。

环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域，如何运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎衣原体在临床诊断技术发展中具有重大意义，因此开发一种简单快速、检测效率高的运用环介导恒温扩增技术来检测肺炎衣原体的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单快速、检测效率高的环介导恒温扩增检测肺炎衣原体的方法及检测试剂盒，本方法提高了肺炎衣原体的诊断效率，解决传统检测方法无法满足临床诊断的发展要求。

本发明所采用的技术方案是：首先通过实验测序得到肺炎衣原体的P1基因序列如序列表NO.5所示，并通过专业软件设计用于环介导恒温扩增技术检测的特异性寡核苷酸引物，以引物序列组扩增待测样品模板，进行目的基因片段的特异性扩增，其检测方法的步骤包括：

(1)基因提取步骤，从待检样品中提取模板DNA；

(2)环介导恒温扩增反应步骤，将上述模板DNA加入反应体系中进行扩增反应，其中所使用的引物序列如下：

F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3

B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3

FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3

BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3；

(3)结果检测步骤，选择以下三种扩增产物检测方法中的任意一种进行检测：

A：将扩增产物离心目测白色沉淀来检测结果；

B：加入显色液观察反应液颜色来检测结果；

C：1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳带形分析检测结果。

上述步骤(2)中环介导恒温扩增反应条件为：

60～65℃    45～90分钟；

80～95℃    3～5分钟。

其中采用A方法检测时，阳性结果会产生白色沉淀。在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增试验都是在61℃左右进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也在不断积累。从而在反应结束后可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。

采用B方法检测时，阳性结果如果加入SYBR Green染料，溶液变为绿色。阳性的环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。而阴性结果由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBR Green也无法同核苷酸链结合，结果只能是橙色。