[发明专利]一种敲除分枝杆菌ksdD基因的方法及其应用

说明书

技术领域

一种敲除分枝杆菌ksdD基因的方法及其应用，属于生物工程中分子生物学领域。

背景技术

分枝杆菌(Mycobacterium)能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮(AD)和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)，其中由ksdD基因编码的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)是AD转化为ADD的关键酶。

雄甾-4-烯-3，17-二酮(androst-4-end-3，17-dione，AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androst-1，4-end-3，17-dione，ADD)是制备甾体药物的重要中间体，甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等。传统生产中AD(D)主要以薯蓣皂素为原料利用化学方法合成，由于化学合成工艺路线繁长、“三废”污染严重，上世纪60年代人们开始采用微生物转化广泛存在于动、植物体内的甾醇生产AD(D)。微生物法具有成本低、对环境友好等优点，因此越来越受到人们的重视。国外对微生物法生产AD(D)的研究起步较早，20世纪50年代，美国Up john公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇为原料生产出AD和ADD。20世纪70年代初，日本的研究学者有马启利用微生物降解胆固醇成功生产了ADD。2002年Dias等将从油脂脱臭蒸馏物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRLB-3805处理得到AD和ADD，且收率较高。国内的研究起步较晚，但已经取得了一定的成绩。

在实际生产过程中由于AD和ADD性质相近，分离纯化十分困难，获得单一的AD(D)成本很高，因此获得单产AD(D)菌株成为国内外研究学者追逐的目标。文献报道表明植物甾醇通过C17边链降解后首先获得AD，进一步由3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)脱氢生成ADD。近年来随着一些微生物编码KSDD的基因ksdD全序列的陆续公布，利用基因工程手段研究KSDD酶学性质以及AD合成ADD的代谢机理成为新的研究方向。

本发明首先构建了分枝杆菌ksdD基因敲除载体，通过电转化方法实现了分枝杆菌中ksdD基因的敲除。

发明内容

本发明的目的在于：对本实验室保藏的一株分枝杆菌，通过构建ksdD基因敲除载体等分子生物学手段实现其ksdD基因敲除，利用筛选培养基筛选得到一株ksdD基因的转化子，并对其KSDD酶活以及AD(D)的产量进行研究。

本发明的技术方案：根据NCBI公布的M.neoaurum strain NWIBL-01ksdD基因全序列设计引物F1、R1，上游引物F1(EcoRⅠ)：5′-accg gaattc gtgttctacatgactgcc，下游引物R1(Hind Ⅲ)：5′-accg aagctt tcaggcctttccagc。以分枝杆菌染色体DNA为模板，以F1、R1为引物，通过PCR扩增出ksdD全序列，将PCR产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，热击转化E.coli JM109，使用氨苄青霉素抗性平板筛选转化子，并对重组质粒进行酶切鉴定和序列分析。根据载体pET28a的卡那霉素抗性基因序列，设计引物F2、R2，上游引物F2(Xho Ⅰ)：5′-accg ctcgag gtatctcagttcggtgtag，下游引物R2(Xho Ⅰ)：5′accg ctcgag ggtggcacttttcggggaaatg。以质粒pET28a为模板，F2、R2为引物，PCR扩增卡那抗性基因(Km)。将质粒T-ksdD与基因Km分别用Xho Ⅰ酶切，酶切产物回收后用T4DNA Ligase 16℃连接过夜，转化E.coli JM109，使用氨苄青霉素和卡那霉素双抗性平板筛选转化子，并对质粒进行酶切鉴定，其中重组质粒即为基因敲除载体T-ksdD::Km。