[发明专利]一种产油微生物RNA的提取方法

权利要求书

1.一种从产油微生物中提取高质量RNA的方法，其特征在于：

产油菌体首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取缓冲液中采用玻璃珠振荡进行细胞破碎，得细胞破碎液；在细胞破碎液中加入有机溶剂去除油脂，离心后取水相，加入醋酸钠、酸性苯酚、氯仿和异戊醇除去胞内蛋白，离心后取水相加入异丙醇沉淀RNA，洗涤沉淀，真空干燥后加入DEPC处理水溶解。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的产油微生物为产油真菌、产油细菌和/或产油微藻。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述产油真菌为Rhodosporidium toruloides、Cryptococcus curvatus、Yarrowia lipolyica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomyces starkeyi、Mortierellaisabellina、Mucor circinelloides、Cunninghamella中的一种或多种，产油细菌为Croynebacterium、Nocardia和Mycobacterium中的一种或多种；产油微藻为Botryococcus braunii、Crypthecodinium cohnii、Chlorellaprotothecoides、Nannochloropsis sp.和Schizochytrium limacinum中的一种或多种。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：具体操作过程为，

1)取细胞密度为1×10⁷-1×10⁸细胞/ml的菌体经液氮速冻的产油菌体研磨破碎0.5-30min至粉末状，刮取粉末装于离心管中，加入RNA提取缓冲液，菌体与RNA提取缓冲液体积比例为10ml∶1-2ml；

2)向离心管中加入玻璃珠间歇振荡，总的破碎时间为0.5-30min；每10ml菌体加入0.5-1.5g玻璃珠；

3)向离心管中加入有机溶剂，充分混匀后0-4℃，12000-18000×g离心5-10min；有机溶剂的量为1/4-3/4RNA提取缓冲液体积；

4)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入浓度为3M、pH为4.6的醋酸钠和体积比为25∶24∶1酸性苯酚/氯仿/异戊醇混合液，充分混匀0-4℃，12000-18000×g离心5-15min；按10ml菌体计，加入100μ1的醋酸钠和1ml混合液；

5)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，置于0--70℃放置5min-16h，然后0-4℃，12000-18000×g离心5-15min获得沉淀的RNA。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：获得的RNA沉淀用70％的乙醇洗涤干燥后加入DEPC处理水溶解保存。

6.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：RNA提取缓冲液为内含4M异硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸钠、25mM柠檬酸钠、pH7.0、0.5wt％巯基乙醇的水溶液。

7.按照权利要求4所述的方法，其特征还在于：所述的玻璃珠振荡破碎方法为间歇振荡，每次振荡10s-10min后置于冰上冷却0.5-10min，总的破碎时间为0.5-30min，玻璃珠直径为0.2-1mm。

8.按照权利要求1或4所述的方法，其特征还在于：所述去除油脂的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、石油醚或它们之间的任意比例混合。