[发明专利]一种产油微生物RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物RNA的提取方法，特别是涉及到产油微生物RNA的提取方法。

背景技术

自然界中部分微生物，如细菌、酵母菌、霉菌和藻类等，能在特定的培养条件下，在胞内贮存质量超过其细胞干重20％(w/w)的油脂，具有这种表型的微生物被称为产油微生物。这些产油微生物所产的油脂主要以脂肪酸甘油三酯的形式存在，其组成与一般的动植物油脂相似。近年来微生物油脂发酵也逐渐成为生物柴油产业和工业生物技术的重要研究方向。相对于一般的微生物来说，产油微生物胞内油脂含量较高。如某些红酵母属的菌株能以糖质原料为碳源的培养基发酵，在胞内积累超过其细胞干重70％(w/w)的油脂(Li YH，Zhao ZB，Bai FW.Enzyme Microb Technol，2007(41)：312-317)，而同时还大量合成色素。这些高含量的油脂与色素对RNA的分离纯化会产生很大的干扰，严重影响提取RNA的质量和产量。而分离提取高质量的RNA是基因表达、调控与基因工程等研究的基础。目前微生物RNA提取方法有很多，单独采用Trizol试剂盒(Gilchrist M，MacDonald AJ，Neverova I，et al.J Immunol methods，1997(201)：207-214)、热酸酚处理(Schmitt ME，Brown，TA，Trumpower LB.Nucleic Acids Res，1990(18)：3091-3092)、玻璃珠破碎细胞(奥斯伯F，金斯顿R，塞德曼J.精编分子生物学实验指南.1998：597-598)和液氮研磨(Sayler GS，Fleming JT，Nivens DE.Curr Opin Biotechnol.2001(12)：455-60)等方法均不能有效的从产油微生物中提取高质量的RNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经济、简单的操作方法，从产油微生物中提取高质量(高纯度)的细胞总RNA。

为了实现上述目的，本发明所采用的操作步骤为：

一种从产油微生物中提取高质量RNA的方法，产油菌体首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取缓冲液中采用玻璃珠振荡(相结合的方式)进行细胞破碎，得细胞破碎液；在细胞破碎液中加入有机溶剂去除油脂，离心后取水相，加入醋酸钠、酸性苯酚、氯仿和异戊醇除去胞内蛋白，离心后取水相加入异丙醇沉淀RNA，洗涤沉淀，真空干燥后加入DEPC处理水溶解。

具体操作过程为，

1)取细胞密度为1×10⁷-1×10⁸细胞/ml的菌体经液氮速冻的产油菌体研磨破碎0.5-30min至粉末状，刮取粉末装于离心管中，加入RNA提取缓冲液，菌体与RNA提取缓冲液体积比例为10ml∶1-2ml；

2)向离心管中加入玻璃珠间歇振荡，总的破碎时间为0.5-30min；每10ml菌体(5ml离心管中)加入0.5-1.5g玻璃珠；

3)向离心管中加入有机溶剂，充分混匀后0-4℃，12000-18000×g离心5-10min；有机溶剂的量为1/4-3/4RNA提取缓冲液体积；

4)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入浓度为3M、pH为4.6的醋酸钠和体积比为25∶24∶1酸性苯酚/氯仿/异戊醇混合液，充分混匀0-4℃，12000-18000×g离心5-15min；按10ml菌体计，加入100μl的醋酸钠和1ml混合液；

5)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，置于0--70℃放置5min-16h，然后0-4℃，12000-18000×g离心5-15min获得沉淀的RNA；

6)获得的RNA沉淀用70％的乙醇洗涤干燥后加入体积比0.01％-0.5％的DEPC处理水溶解保存。

RNA提取缓冲液为内含4M异硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸钠、25mM柠檬酸钠、pH 7.0、0.5wt％巯基乙醇的水溶液。

所述的玻璃珠振荡破碎方法为间歇振荡，每次振荡10s-10min后置于冰上冷却0.5-10min，总的破碎时间为0.5-30min，玻璃珠直径为0.2-1mm。

所述去除油脂的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、石油醚或它们之间的任意比例混合。

本发明区别于传统的微生物RNA提取方法，为了快速的破碎细胞，采用液氮研磨和玻璃珠振荡相结合的方式。

本发明加入有机试剂，有效的去除了产油微生物胞内大量油脂及色素，减少了对RNA分离纯化的干扰。