[发明专利]Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞共培养体系，尤其是一种简单有效的体外T细胞定向分化的体系，即Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法。

背景技术

人体对自身的病变细胞和病原体的清除由免疫系统来承担。免疫系统的细胞成分主要由B细胞、T细胞及树突状细胞等抗原递呈细胞来完成。T细胞分为细胞杀伤CD8T细胞和CD4助细胞。由于T细胞在自身免疫性疾病、病毒感染、肿瘤杀伤、细菌及真菌感染中的重要作用，T细胞及人工改造的抗原特异性细胞被用来治疗肿瘤、对特定病毒缺乏免疫力的病原体感染和针对自身的过度免疫反应。体外人工诱导功能性T细胞并赋于其抗原特异性是治疗自身免疫生疾病、久治不愈的感染性疾病的有效手段之一。

在一种简单的单层基质细胞的作用下，能够分化出T细胞的这种能力不仅有助于解决关于T细胞的产生需要分子间的相互作用的基础性问题，而且提供一个研究T细胞发育的新系统。在发现OP9-DL1细胞之前，研究T细胞的发育需要FTOCs。这种FTOCs虽然有效，但是很复杂而且效率相当低。因此，需要发明一种新的简单有效的体外T细胞分化体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，设计了一个操作简便、效率高的OP9-DL1细胞体外共培养体系，体外获得T细胞。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法，包括以下步骤：(1)OP9-DL1细胞失去支持HSCs发育成为B细胞的能力；(2)OP9-DL1获得诱导HSCs发育成为T细胞的正常的程序。

具体地说，OP9-载体和小鼠Delta-like 1转导OP9细胞基质细胞系保存在添加了20％牛血清的改良培养基中；干细胞因子Flt3-L和IL-7的浓度依照R&D使用说明添加，祖细胞接种到平板的前一天，每个孔板中的基质细胞数要达到2×10⁴；将祖细胞以不同的密度添加到不同孔板的基质细胞，确定产生最佳淋巴细胞的祖细胞添加浓度；培养一周后，用0.53m MEDTA/PBS，pH7.4来收集基质细胞和造血细胞，然后，3000-10000的造血细胞与基质细胞共同转接到新鲜的基质细胞进行传代培养；经过几周的分化观察后，用基质细胞通过VCAM-1抗体染色的方法被去除，而死亡细胞则通过7-aminoactinomycinD染色被去除，当造血细胞的得率达到95％，此培养条件和细胞密度可取。

本发明的有益效果是：OP9-DL1细胞体外共培养体系，可以诱导许多不同来源的祖细胞发育成为T细胞。到目前为止，我们已经可以高效的诱导或者说支持分化为T细胞的干细胞有小鼠胚胎肝细胞来源的HSCs，从骨髓来源的HSCs，未分化的ESCs，骨髓来源的淋巴祖细胞，胸腺来源的祖细胞和人Cord血来源的HSCs。

具体实施方式

小鼠胚胎：嵌入RAG-1/GFP基因的雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配产生的RAG-1/GFP胚胎。

OP9共培养：OP9-载体和小鼠Delta-like 1转导OP9细胞基质细胞系保存在添加了20％牛血清的改良培养基中。干细胞因子Flt3-L和IL-7的浓度依照R&D使用说明添加。祖细胞接种到平板的前一天，每个孔板中的基质细胞数要达到2×10⁴。然后，将祖细胞以不同的密度添加到不同孔板的基质细胞，目的是为了确定产生最佳淋巴细胞的祖细胞添加浓度。培养一周后，用0.53m M EDTA/PBS(pH7.4)来收集基质细胞和造血细胞。然后，3000-10000的造血细胞与基质细胞共同转接到新鲜的基质细胞进行传代培养。经过几周的分化观察后，用基质细胞通过VCAM-1抗体染色的方法被去除，而死亡细胞则通过7-aminoactinomycinD染色被去除。当造血细胞的得率达到95％则认为此培养条件和细胞密度可取。

细胞分选：骨髓阴性细胞的获取和富集是通过与标记抗体的混合孵化，包括CD45RA，CD19，Gr-1，CD11b/Mac-1，Ter-119；然后通过MACS细胞分离系统分离阴性细胞部分。阳性细胞则被电子控出。

移植：移植前4小时，同类系LY5.1小鼠要经过单剂量960rad的照射。然后，10⁵受体骨髓细胞与10⁵Lin_c-Kit_Sca-1_分离细胞混合，注射到受体内。经过21-28天观察细胞注射和分化情况，并观察其致瘤性。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。