[发明专利]盖塔病毒全基因组序列、扩增方法及引物

说明书

技术领域

本发明涉及甲病毒属西门利克森林病毒复合组，特别是盖塔病毒全基因组序列、扩增方法及引物。

背景技术

盖塔病毒属于甲病毒属西门利克森林病毒复合组，主要分布在东南亚和澳大利亚北部太平洋沿岸。此病毒能够引起猪、马等牲畜发热、皮疹、后肢水肿、淋巴结肿大及流产等症状。在我国通过对发热病人血清筛查发现零星病例盖塔病毒中和抗体阳性，说明此病毒和人类疾病相关联，需要进行深入研究。

发明内容

本发明目的是提供盖塔病毒(GZ0885株)全基因组序列、扩增方法及引物，并进一步提供盖塔病毒全基因组序列快速测定方法，这一发明对获得盖塔病毒全基因组序列并应用于研究盖塔病毒进化及其分子流行病学具有重要意义，同时本发明为制备盖塔病毒疫苗株提供最佳候选株，将盖塔病毒适应于哺乳动物细胞，为盖塔病毒的预防与控制提供保障。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

盖塔病毒(GZ0885株)全基因组序列扩增方法，它包括：

1、盖塔病毒适应哺乳动物来源细胞系及盖塔病毒的纯化；

2病毒RNA的提取；

3、病毒RNA的逆转录；

4、病毒全基因组序列扩增引物的设计与合成；

5基因片段的PCR扩增；

6、PCR产物直接进行序列测定及序列拼接。

具体实施方式

实施例：

1、盖塔病毒适应哺乳动物来源细胞系及盖塔病毒的纯化

在P2实验室取在C6/36细胞传代三次含盖塔病毒的细胞上清感染BHK-21(金黄地鼠肾)细胞[培养液：MEM培养液，1％谷胺酰胺(30g/l)，2％双抗(青、链霉素10,000U/l)，2％NaHCO₃(75g/l)，10％胎牛血清]，并在BHK-21细胞上进行连续传代使其适应于BHK-21细胞，并能在BHK-21细胞上引起稳定的细胞病变，为制备盖塔病毒疫苗株提供候选株。

将病毒培养细胞上清用MEM维持液[1％谷胺酰胺(30g/l)，2％双抗(青、链霉素10,000U/l)，2％NaHCO₃(75g/l)，1％胎牛血清]稀释成：0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001。分别由低到高加0.1ml的病毒稀释液于6孔板的长到单层的BHK-21细胞，吸附1小时后，加入3ml琼脂糖覆盖物[1％琼脂，1％谷胺酰胺(30g/l)，2％双抗(青、链霉素10,000U/l)，2％NaHCO₃(75g/l)，1％胎牛血清]，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中培养48小时。加入0.5ml 1％的中性红，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中培养过夜，观察形成的空斑，并将形成的单个空斑挑到长满单层的BHK-21细胞瓶中，进行下轮的空斑筛选，重复此操作进行三次空斑筛选。将三次空斑筛选后的病毒进行大量培养，三次冻化后分装保存于-80℃冰箱备用。

2、病毒RNA的提取

利用QIAGEN公司(德国)的QIAamp Viral RNA Extract试剂盒，操作按说明书进行，即：(1)取一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液(含CarrierRNA)；(2)向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s；(3)室温下(15℃～25℃)放置10min，然后瞬时离心；(4)加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心；(5)小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中(试剂盒附带)，将QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；(6)弃去收集管中的液体，重复第6步骤；(7)弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液，8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；(8)弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液，8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；(9)弃去收集管中的液体，13000rpm再次离心1min；(10)将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；(11)向膜上加入50μl的FB缓冲液，然后室温下静置2～5min；(12)在离心机中以8000rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。洗脱的RNA立即使用或存放于-80℃条件。

3、病毒RNA的逆转录

利用Ready-to-Go^TM You prime First-Strand Beads试剂盒(英国GEHealthcare公司)制备cDNA。