[发明专利]双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，由半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得免疫抗原，免疫新西兰大白兔后获得，其特征在于：半抗原是由的双甲胺草磷过渡态类似化合物引入羧基制备，所述双甲胺草磷过渡态类似化合物为分子结构式(4)，

其化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-氨基硫代磷酰胺酯，分子量为：276.249。

2.根据权利要求1所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，其特征在于：所述的双甲胺草磷过渡态类似化合物是这样合成的：

1)以三氯硫磷与甲醇为原料，溶液温度控制在-5℃以下进行反应，冰水洗涤溶液留取下层，得到甲氧基硫代磷酰二氯，为分子结构式(6)：

2)在5～10℃丙酮溶液温控条件下，以三乙胺为催化剂，甲氧基硫代磷酰二氯与2，4-二甲基-6-硝基苯酚(DMNT)，氢氧化钠(NaOH)反应获得含有分子结构式(5)化合物的丙酮溶液，

3)在5～10℃溶液温控条件下，向预冷的含有分子结构式(5)化合物的丙酮溶液中滴加氨水，以氢氧化钠调节溶液pH为10进行反应，得到双甲胺草磷过渡态类似化合物，分子结构式(4)。

3.根据权利要求1或2所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，其特征在于：适合动物免疫的半抗原-载体蛋白偶联物，如分子结构式(1)，

其中，R为BSA或OVA

4.一种如权利要求1所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：

a)以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，使所述分子结构式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物与琥珀酸酐(Succinic anhydride)在50℃温控乙腈溶液中反应，获得分子结构式(3)的化合物，形成半抗原，

b)在温控为0℃的除水的二氯甲烷溶液中，以DMAP为催化剂的条件下，分子结构式(3)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)反应过夜，获得溶有分子结构式(2)的化合物活化酯，

c)以pH为9的溶有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与溶有分子结构式(2)的化合物活化酯的DMF溶液在4℃温度条件下反应过夜，获得含有分子结构式(1)的半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液；

d)将含有半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得免疫抗原；

e)再将免疫抗原用于免疫新西兰大白兔，获得双甲胺草磷的多克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：免疫新西兰大白兔前，d步骤获得的免疫抗原应该分装保存于-20℃冰箱中备用。

6.一种如权利要求1所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用，其特征在于：将多克隆抗体建立的间接竞争性ELISA法对水样中双甲胺草磷(H-9201)农药的残留进行检测，检测中使用的包被抗原是这样获得的：

在权利要求4所述多克隆抗体的制备方法的a～b步骤的基础上，以pH为9的溶有卵清蛋白OVA的磷酸盐缓冲液，与溶有分子结构式(2)的化合物活化酯的DMF溶液在4℃温度条件下反应过夜，获得含有分子结构式(1)的半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液；

将含有半抗原-载体蛋白偶联物的反应混合液装入透析袋中，在去离子水中4℃透析3天，每8小时换水一次，透析结束后获得包被抗原。

7.根据权利要求6所述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的应用，其特征在于：多克隆抗体采用间接竞争性ELISA法对水样中双甲胺草磷(H-9201)农药的残留进行检测是指：将被测水样经简单过滤净化处理、提取后制备得到ELISA待测液，然后利用间接竞争性ELISA法进行检测，计算得出待测样品中的双甲胺草磷(H-9201)含量。