[发明专利]双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种双甲胺草磷(H-9201)多克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术：

双甲胺草磷(H-9201)是由我国自主研发的，具有独立知识产权的一种新型农用除草剂，该化合物是利用活性与构效关系(QSAR)预测了其活性，并合成的新化合物，其化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-N-异丙基硫代磷酰胺酯，分子量为318.5，是一种硫化磷酰胺酯类化合物，商品名为双甲胺草磷。该化合物是一种内吸传导型选择性土壤处理水旱两用除草剂，可用于大豆、水稻、小麦、玉米、蔬菜等作物，防除多种一年生单、双子叶杂草，杀草谱广，且可与多种除草剂品种复配，田间药效试验未发现对后茬作物生长的影响，是一种具有广泛应用价值的新型除草剂品种。

目前对双甲胺草磷(H-9201)残留检测的研究报道仅见气相色谱法(参见张存政，张志勇，刘媛，王冬兰，刘贤进.新型除草剂双甲胺草磷(H-9201)在胡萝卜和土壤中的残留动态研究.分析科学学报，2007，23(3)：337-339.)，有关双甲胺草磷(H-9201)的抗体制备以及免疫分析法及其在残留检测中的应用，国内外均未见文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前双甲胺草磷(H-9201)抗体匮乏，提供一种半抗原为设计合成的结构为分子式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物的双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明的目的是这样实现的：一种双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体，由半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联获得免疫抗原，免疫新西兰大白兔后获得，其特征在于：半抗原是由的双甲胺草磷过渡态类似化合物引入羧基制备，所述双甲胺草磷过渡态类似化合物为分子结构式(4)，

化学名称为：O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-氨基硫代磷酰胺酯，分子量为：276.249。

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体中，适合动物免疫的半抗原-载体蛋白偶联物的结构为分子式(1)，

其中，R为BSA或OVA。

它是以设计合成的双甲胺草磷过渡态类似化合物为半抗原，以琥珀酸酐为桥梁，使一个羧基与半抗原的氨基联结，继尔以活性酯法使之与载体蛋白偶联后获得的：

上述设计合成的双甲胺草磷过渡态类似化合物的合成具体步骤如下：

(1)分子结构式(6)的甲氧基硫代磷酰二氯的合成

三氯硫磷预冷后，缓慢滴加甲醇，溶液温度控制在-5℃以下，三氯硫磷∶甲醇的克分子比1∶5。甲醇滴加完毕后，持续搅拌15min。冰水洗涤溶液。分层后，取下层，获得甲氧基硫代磷酰二氯，-20℃保存，分子结构式(6)。

(2)分子结构式(5)化合物的合成

将30ml甲氧基硫代磷酰二氯、DMNT的丙酮混合液预冷至5～10℃，滴加三乙胺催化反应，监测pH约为6；将20％氢氧化钠水溶液，滴加到反应液当中，滴加完后pH约为12；反应体系中甲氧基硫代磷酰二氯∶DMNT∶NaOH的克分子比为1∶1∶1.1。反应溶液抽滤除去盐酸盐后保存滤液，获得含有结构为分子式(5)化合物的丙酮溶液。

(3)分子结构式(4)的双甲胺草磷过渡态类似化合物的合成

将含有为分子结构式(5)化合物的丙酮溶液预冷至5～10℃，向其中滴加氨水。氨水滴加完后pH约为8，滴加40％的氢氧化钠水溶液至PH为10，脱去丙酮，加入30mL乙醚分两次萃取，水洗涤乙醚层，经无水硫酸镁干燥后，脱去乙醚。柱层析分离，取中间的组分，脱去溶剂，获得双甲胺草磷过渡态类似化合物，为分子结构式(4)。

上述双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备，其特征在于：用活性酯法使半抗原与牛血清白蛋白偶联，合成免疫抗原，再将免疫抗原用于免疫新西兰大白兔，获得双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体。

在双甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗体的制备中：活性酯法合成免疫抗原的步骤是：