[发明专利]抗轮状病毒药物作用靶标及其构建方法和应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物作用靶标，特别涉及一种抗轮状病毒药物作用靶标，还涉及该靶标的构建方法，以及应用该靶标筛选抗轮状病毒药物的方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)感染是导致婴幼儿腹泻的主要病因，每年引起约1.25亿例儿童胃肠炎，导致352,000-592,000例5岁以下儿童因轮状病毒感染死亡，主要发生在发展中国家。

轮状病毒属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链RNA(dsRNA)病毒，11条dsRNA各缠绕1分子的RNA依赖RNA多聚酶(VP1)和1分子的鸟苷酸及甲基转移酶(VP3)位于病毒颗粒的核心，编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白(VP1～4、6～7)与6种非结构蛋白(NSP1～6)。VP2构成轮状病毒的内层衣壳包裹病毒基因组；VP6构成的中层衣壳包绕VP2形成轮状病毒双层衣壳颗粒(DLP)；VP4和VP7构成的外层衣壳再包绕DLP形成完整的轮状病毒三层衣壳颗粒(TLP)。轮状病毒在受体的介导下穿过细胞膜进入细胞，脱掉外层衣壳形成DLP开始复制过程，新生成的病毒dsRNA与蛋白在胞浆中聚集形成病毒质粒，并在其中组装生成DLP，DLP不具有感染能力，其随后进入内质网，与新合成的VP4和VP7装配成具有感染能力的TLP并分泌出宿主细胞，完成病毒的复制过程。

在病毒复制过程中，病毒组分(新生的病毒核酸与蛋白等)装配成完整的病毒颗粒是非常关键的步骤，正确而高效地装配直接决定着病毒产生的水平。在病毒装配过程中，病毒各组分被转运到细胞内的特定位置，自发地或在病毒编码的形态发生因子指导下进行衣壳装配。宿主因素对病毒颗粒的组装有着重要的影响。病毒核酸或蛋白必须在细胞内经过合适的折叠及修饰(如糖基化等)并被转运到正确的位置才能有效的进行装配。目前已经发现一些宿主蛋白如groE、ABCE1、Staufen1等在病毒颗粒的组装过程中发挥着重要作用。一旦这些宿主蛋白的功能出现异常，就会导致病毒颗粒结构或功能的缺陷，影响病毒的有效复制。

目前对感染后宿主细胞对病毒感染的反应机制知之甚少。对轮状病毒感染宿主细胞后引起宿主细胞的反应进行研究，有助于深入了解轮状病毒与宿主细胞间相互作用的特点，从而为进一步研究如何预防或治疗轮状病毒感染及开发抗轮状病毒药物提供有益的借鉴。病毒感染宿主细胞后引起宿主细胞发生一系列反应，包括基因与蛋白表达的改变、干扰素反应及细胞表面分子的调节。研究表明，轮状病毒感染后会导致宿主细胞出现一系列变化，引起细胞蛋白表达水平显著下降，细胞内Ca²⁺浓度改变(与病毒成熟也可能与细胞死亡有关)，细胞骨架的组织构建的改变，细胞间紧密连接的结构与功能的改变及细胞死亡裂解。对轮状病毒感染的细胞中蛋白质表达特点的研究有助于了解病毒的致病机理。近年来对轮状病毒感染细胞中一些细胞基因的mRNA及蛋白质表达水平已经有了一些研究。AIMIN等通过Northern blot和二维凝胶电泳技术发现，在轮状病毒SA11株感染的MA104细胞中，两种存在于内质网中的分子伴侣GRP78和GRP94在mRNA及蛋白水平表达均升高。Rollo等研究发现在猴轮状病毒感染的HT-29细胞中，多种趋化因子及干扰素的mRNA表达水平升高。Mariela等用含人类38,000种cDNA的基因芯片对轮状病毒感染的人肠细胞系Caco-2研究发现，在感染后16小时，508种基因的表达发生大于2倍的变化，其中73％是上调且大部分发生在感染12小时后。但是鉴于细胞内复杂的基因表达和翻译调控机制，mRNA的改变并不必然等同于蛋白质的改变，而蛋白质才是各种生命活动的直接参与者。因此，对轮状病毒感染后尤其是在感染早期细胞蛋白表达谱改变的研究，将有助于深入认识宿主细胞对轮状病毒感染的反应特点。