[发明专利]一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺

权利要求书

1.一种生物法生产重组大肠杆菌外源蛋白的生产工艺，其特征在于发酵过程采用将两阶段温度控制工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵工艺、诱导控制工艺相结合的生产工艺。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于以含有重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的大肠杆菌为出发菌株，其生产工艺如下：

(1)分批发酵阶段：通过调节搅拌转速或者通入富氧空气的方式将溶氧维持在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，培养5-6小时；

(2)补料培养阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h^-1的比生长速率生长，通过提高搅拌转速或者通入富氧空气维持溶氧在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时一次性添加质量分数为0.75-1.5％的甘氨酸；

(3)诱导阶段：当菌体OD₆₀₀达到45-60时，将温度降为23-27℃，采用梯度递减的方式流加乳糖，流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1，通过提高搅拌转速或者通入氧气维持溶氧在20-30％，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，诱导20小时。

3.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于补料培养阶段指数流加速率F由得到，方程中X和S分别为细胞和底物浓度(g/L)，μ为为比生长速率(h^-1)，V为发酵液体积(L)，S_F为补加底物的浓度(g/L)，Y_X/S为细胞对底物的得率系数(g/g)，(VX)₀为培养体系的初始细胞量(g)，t为流加时间(h)。

4.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于诱导阶段以16-20g·L^-1·h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速；同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1。

5.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于所述补料液为：甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。

6.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于所述发酵培养基的组成为：甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L。

7.根据权利要求6所述的生产工艺，其特征在于所述微量元素液为：以5M HCl为母液，FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂ 2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L。

8.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL10g/L，pH7.10。

9.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于种子培养基中还含有浓度为100mg/L的氨苄青霉素。

10.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于发酵培养基中还含有浓度为100mg/L的氨苄青霉素。