[发明专利]一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺

说明书

技术领域

一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺，属于发酵工程技术领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶，EC 2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精(CDs)的胞外酶，可以分成α-，β-和γ-三种类型。环糊精具有独特的疏水环状圆桶型的分子结构，可以对各种有机化合物进行包接复合和分子识别，从而改变和保护客体化合物的理化性质。因此环糊精在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。但目前环糊精的生产由于转化率低、提纯制备以及分离困难等原因导致成本太高，它们的许多应用受到了很大的限制。为了有效降低环糊精的生产成本，大幅度提高CGT酶产量起着至关重要的作用。目前，国外对CGT酶的研究较多也比较深入，而我国对此酶的研究尚处于起步阶段。国内的研究集中在CGT酶的生产方面，主要包括筛选和诱变野生菌、产酶发酵条件优化等方面，基因工程菌的研究不多。现在国内能生产CGT酶的企业只有少数几家，产量不高，而且全部为环糊精生产企业，基本上是自给自足。

产CGT酶的微生物种类众多，现在工业上生产环糊精所使用的CGT酶来自芽孢杆菌属，但它们产CGT酶的能力普遍较低。为了克服野生菌株较低CGT酶生产能力，运用基因工程的方法将有关CGT酶基因在大肠杆菌中表达已成为当今研究的热点。本实验室成功构建含有周质分泌型信号肽的表达载体pET20b(+)/cgt并转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，通过在摇瓶发酵条件优化以及在3L发酵罐上发酵条件的优化，成功实现了α-CGT酶的高效胞外表达，为其大规模生产奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺，以解决现有发酵工艺中酶活不高，难以实现工业化应用的问题。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

(1)菌株：

大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)为出发菌株(成成，李兆丰，李彬，刘花，陈坚，吴敬，利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶，生物加工过程，2009，7(3)56-63)；

(2)种子培养阶段：

将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度35℃，初始pH值7.10，培养时间10小时；

(3)发酵培养：

批式培养阶段：将种子培养液按5-10％的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速或通入富氧空气使溶氧维持20-30％，控制温度为33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，培养5-6小时；

分批发酵阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h^-1的比生长速率生长，通过控制搅拌转速或通入富氧空气维持溶氧在20-30％，温度维持在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时一次性添加质量分数为0.75-1.5％的甘氨酸；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到45-60时，将温度降为23-27℃，诱导阶段以16-20g.L^-1.h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速，同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1，通过控制搅拌转速或通入富氧空气维持溶氧在20-30％，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，诱导20小时。

所述大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)的构建方法为：将来源于Paenibacillusmacerans JFB05-01(菌种保藏在国家典型微生物保藏中心，保藏号：CCTCC M203062)的α-CGT酶基因(陈坚，吴敬，李兆丰，李彬，成成.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达[P].中国专利，申请号200810024162.3,2008.)插入商业化的质粒pET-20b(+)的信号肽序列下游，构建了表达载体pET-20b(+)/cgt，并将其转化商业化的宿主菌E.coli BL21(DE3)。

所述种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10。