[发明专利]一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种由水泡性口炎病毒(VSV)引起疾病的检测方法，尤其是提供了一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。

背景技术

水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus，VSV)引起的一种急性、热性、高度接触性的人畜共患传染病。以在口腔粘膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮出现水泡为特征，现已成为世界范围内A类人兽共患病。

目前，常规的VSV检测技术主要有病毒分离鉴定、中和试验、补体结合试验、琼脂扩散试验等。上述方法在用于临床上快速、准确地诊断该病时都存在着不同程度的缺陷，不适于现场检测。因此，研究一种简单、快捷的VSV检测方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条，具有特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点。

本发明提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。

本发明提供的水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条，它包括：

样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线、质控线。其中金标垫包被有纯化的VSV-G蛋白胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的VSV抗原，质控线包被有兔抗VSV高免血清，质控线一侧贴有吸收垫。

本发明水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)VSV的增殖和纯化：将VSV病毒接种长满单层的BHK-21细胞，细胞达80％时，收获细胞培养病毒液，反复冻融2次后，用差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒；

(2)VSV多克隆抗体的制备：将纯化的VSV分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等比例混合乳化后作为免疫原，免疫家兔，待抗体效价达到10⁵时，用非乳化抗原加强免疫一次3d后兔颈静脉放血分离血清；应用A-Sepharose亲和层析法纯化血清IgG，-20℃保存备用；

(3)VSV-G蛋白的原核表达与纯化：提取纯化VSV的RNA，扩增VSV-G蛋白基因片段，构建重组表达质粒pGEX-G，并在大肠杆菌中诱导表达，利用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达的蛋白；

(4)胶体金溶液及金标蛋白的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，确定胶体金与VSV-G蛋白用量比例，制备金标VSV-G蛋白偶联标记物，采用低温超速离心法纯化金标VSV-G蛋白；

(5)试纸条的组装：将金标VSV-G蛋白用喷点仪喷点玻璃纤维素膜，纯化的VSV和VSV高免血清IgG分别喷涂于硝酸纤维膜检测线和质控线上，将处理好的硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫等材料按顺序进行粘贴、组装、切条、密封，4℃保存。

本发明抗体胶体金检测试纸条的使用方法

1.用1.5ml样品管，采血0.5～1ml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。

2.将试纸条垂直插入含血清样品100～150ul的离心管中，注意不要超过样品垫1，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。

结果判断：

1.阳性：在检测线和质控线处，各出现一条红色条带，判定为阳性；检测线条带色泽的深浅，依检测样品中VSV抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。

2.阴性：在质控线出现一条红色条带，检测线未出现一条红色条带，说明检测样品中无VSV抗体存在。

3.无效：仅在检测线显色或在检测线和质控线均无明显条带出现，视为试纸条检测无效(图2)。

本发明试纸条特异性试验：

用本发明试纸条对水泡性口炎病毒(VSV)阳性血清、羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orf-V)阳性血清、狂犬病病毒(RV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清及猪水疱病病毒(SVDV)阳性血清进行检测。结果仅VSV阳性血清出现明显的检测线和对照线，其余血清检测均为阴性。说明该试纸条具有很好的特异性。

本发明试纸条敏感性试验：

将高免阳性血清作1∶100倍稀释后，按2倍进行递减稀释，然后进行检测。结果同一份VSV阳性高免血清，间接ELISA检测，最低检出量为1∶1600-3200，用本发明试纸条(GICA)进行检测，最低检出量为1∶1600。本发明胶体金免疫试纸条敏感性比ELISA低一个稀释度。

本发明试纸条符合率试验：