[发明专利]一种小RNA的定量检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种小RNA的定量检测方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)bulge loop RT引物将小RNA反转录为cDNA，所述bulge loop RT引物具有40-60个核苷酸，从5’端至3‘端有分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；

(2)加入PCR正向引物和PCR通用反向引物进行定量PCR扩增，正向PCR引物为具有20-40个核苷酸序列，从5’端至3‘端分别为延伸部分和小RNA相似部分；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列的一部分，其长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和要大于或等于小RNA的全长；PCR反向通用引物长度为具有20-40个核苷酸的序列。

2.根据权利要求1所述的小RNA的定量检测方法，其特征是，所述PCR反向引物和/或所述bulge loop RT引物的延伸部分具有LNA或甲基化修饰。

3.根据权利要求1或2所述的小RNA的定量检测方法，其特征是，所述茎3部分与茎1和茎2部分互补配对长度为6-12碱基对；所述延伸部分的长度为3-12个碱基；所述正向PCR引物为28-32个碱基。

4.一种小RNA定量检测试剂盒，其特征是，主要包括有：

(A)具有40-60个核苷酸的bulge loop RT引物，从5’端至3‘端分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；

(B)具有20-40个核苷酸的正向PCR引物，从5’端至3‘端分别为延伸部分，小RNA相似部分，小RNA相似部分的长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和大于或等于小RNA的全长；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列的一部分。

5.根据权利要求4所述的小RNA定量检测试剂盒，还包括有具有20-40个核苷酸的PCR反向通用引物。

6.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：1、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：3；或所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：2的序列、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：4；或所述bulge loopRT引物是碱基组成为SEQ.NO：6的序列、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：7。

7.根据权利要求6所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述PCR反向通用引物为SEQ.NO：5。

8.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述bulge loop RT引物的延伸部分3’端进行LNA或甲基化修饰。

9.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述PCR反向引物5’或3’端进行LNA修饰或甲基化修饰。

10.根据权利要求4-9任一项所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述茎3部分与茎1和茎2部分互补配对长度为6-12碱基对；所述延伸部分的长度为3-12个碱基。