[发明专利]一种小RNA的定量检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种小RNA的定量检测方法及试剂盒。

背景技术

生物体内的小RNA包括microRNA(微小RNA，miRNA)、small interference RNA(小干扰RNA，siRNA)、piwi protein related RNA(piwi蛋白相关RNA，piRNA)、small nuclearRNA(胞核小RNA，snRNA)、small nucleolar RNA(核仁小RNA，snoRNA)等，这些小RNA在生物体内发挥多种多样的功能，miRNA与siRNA主要负调节编码基因的表达，piRNA主要正调控基因的表达，snRNA参与蛋白的加工成熟，snoRNA参与剪接rRNA，随着研究的深入，各种小RNA的新的功能和机制被正在不断的被研究揭示。

miRNA是目前研究最热门的小RNA之一，它是一类长度约为22bp，由dicer酶从有特定二级结构的前体剪切加工成熟的，通过与mRNA完全或不完全配对来调节基因的表达的RNA分子，它属于非编码小RNA家族的一员，在物种之间是保守的。目前在miRNA数据库中(http://www.sanger.ac.ck/)注册的人的miRNA为695条(Griffiths-Jones et al.，2008)。miRNA参与调节细胞的生长，繁殖，分化，调亡等生命过程。超过一半的人类miRNA基因在基因组的位置被认为与癌症有关，如脆性位点，扩增相关的窄位点区，或者断裂位点区。

siRNA是指在RNAi过程中诱发同源mRNA高效特异降解的双链小RNA。19个核苷酸的siRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了(Brummelkamp.T.R，Bernads.R，Agami.R.A system for stable expression ofshort interering RNAs in Mammalian cells.Science.2002；296：550-553)。siRNA可以在生物体内自主产生，也可以通过体外制造后转染进体内。

piRNA是从哺乳动物生殖细胞分离得到的一类长度约为30个核苷酸的单链小RNA，它与piwi家族蛋白结合发挥基因的表达调控作用(Aravin.A，et al.，A novel class of smallRNAs bind to MILI protein in mouse testes.Nature，2006；442(7099)：203-207；Girard.A，et al.，A germline specific class of small RNAs binds mammalian PIWI proteins.Nature，2006，442(7099)：199-202.)。目前对其生成和功能机制了解较少。

目前检测小RNA的方法主要包括northern印迹、invader assay、定量PCR，microarray等方法。northern印迹法操作繁琐，检测灵敏度低，而且有可能用到放射性探针。Invaderassay需要一个信号探针和一个侵入探针，信号探针的5‘端与靶miRNA部分不配对，这部分在侵入探针存在的情况下被核酸外切酶切除，同时产生荧光信号，这种方法需要使用荧光探针，缺少扩增作用，检测灵敏度受到显著(Allawi.H et al.，Quantitation of microRNAsusing a modified invader assay.RNA 2004，10：1153-1161.)。直接定量PCR方法可以用来检测小RNA的前体，无法用来检测短片段的小RNA，后来对定量PCR进行了改进，采用人为延长小RNA的方法达到定量检测小RNA的目的(chen.KF et al.，2005)，但是该方法需要使用Taqman探针。microarray’是在northern检测RNA基础上建立的一种芯片杂交方法，但是这种方法的检测灵敏度低，假阳性率高，可能要使用放射性探针。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种小RNA的检测方法，该方法可以高灵敏度，高特异性的扩增小RNA，，从而可用于小RNA的表达谱研究。

实现上述目的的技术方案如下：

一种小RNA的检测方法，包括以下步骤：