[发明专利]环介导等温扩增检测人巨细胞病毒的方法、检测用试剂盒和引物组

权利要求书

1.检测人巨细胞病毒的LAMP扩增用特异核酸引物组，其特征在于包含扩增人巨细胞病毒基因UL122特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，以及第一环引物LF和/或第二环引物LB：

UL122-F3：CCGATCCTCTGAGAGTCTGC

UL122-B3：AGTGTCCTCCCGCTCCTC

UL122-FIP：GGGTGACACCAGAGAATCAGACCTAGTGTGGATGACCTACGG

UL122-BIP：CCGCGACTATCCCTCTGTCCT CCTCTTCCTCATCACTCTGC

UL122-LF：AGGCTACAATAGCCTCTTCCTC

UL122-LB：CTGAGAACAGTGATCAGGAAGAAA

所述引物与基因UL122的172077-172342bP位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

2.检测人巨细胞病毒的LAMP扩增用特异核酸引物组，其特征在于包含扩增人巨细胞病毒基因US14特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，以及第一环引物LF和/或第二环引物LB：

US14-F3：TGTGATAGATTAGTGTTTCG

US14-B3：ACCTCCACACTTTTGAC

US14-FIP：GCTACATCGCCACCAAAAT-GTGGCGTAAAGTATCAGC

US14-BIP：GCACGTCTTGGAAAAGGAC-CTTCTACTTACACCTGGTTAC

US14-LF：ACGTCATCCGCAGCT

US14-LB：AGAGACACAGCAAAGTCT

所述引物与基因US14的172077-172342bP位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

3.一种人巨细胞病毒的检测方法，其特征在于，以人巨细胞病毒的UL122基因库登陆号：BK000394基因序列的172077-172342bP位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用权利要求1所述的引物选择性扩增所述靶区域，确认是否存在扩增产物。

4.一种人巨细胞病毒的检测方法，其特征在于，以人巨细胞病毒的US14基因库登陆号：BK000394基因序列的203423-203633bP位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用权利要求2所述的引物选择性扩增所述靶区域，确认是否存在扩增产物。

5.根据权利3所述的人巨细胞病毒的检测方法，其特征在于，所述选择性扩增所述靶区域，确认是否存在扩增产物，是指：

1)提取DNA作模板；

2)环介导等温扩增

①配制扩增反应液：10×Thermopol反应缓冲液、400-1600uM dNTP、2-6mM硫酸镁、1-3uM权利要求1所述正向内引物、1-3uM权利要求1所述反向内引物、0.2-0.3uM权利要求1所述正向外引物、0.2-0.3uM权利要求1所述反向外引物、1-2uM权利要求1所述第一环引物、1-2uM权利要求1所述第二环引物和1-1.5M甜菜碱；  其中10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

②配制酶液：每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶；

③取所述扩增反应液，先加所述待检模板，再加所述酶液，最后加双蒸水，形成总体积为20～50ul的反应体系，混匀后在约63℃条件下恒温保温约60分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶；

3)LAMP反应产物的检测：

A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，

B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green-I 1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，

C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。