[发明专利]重组缺失型人角质细胞生长因子Ⅰ型的化学偶联物

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及缺失型人角质细胞生长因子I型的重组制备，缺失型人角质细胞生长因子I型的聚乙二醇修饰，以及修饰后的纯化和其应用。

背景技术

迄今为止，已发现两种角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)，即角质细胞生长因子I型(KGF-I)和角质细胞生长因子II型(KGF-II)。它们分别是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族的成员，又命名为FGF-7和FGF-10(Aaronoson SA.et al.J.Annals of the New York Academy of science，1991，638：62-77.)。KGF-I最初由Rubin等人(Rubin，J.S.，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，1989.86(3)：p.802-6.)从人胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化的，并发现具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故将其定名为角质细胞生长因子。KGF-II是Emoto等(Emoto H Tagashira S MatteiMG，Journal of biology chemistry，1997(37))于1997年从肺中分离出编码人KGF-II的cDNA。

人角质细胞生长因子I型(human keratinocyte growth factor，hKGF-I)位于15号染色体，其cDNA编码194个氨基酸残基，包括一段21个氨基酸的分泌信号肽。成熟的hKGF-I为一含163个氨基酸残基的单链多肽。临床前研究和临床研究显示，人角质细胞生长因子I型是一种多功能的生长因子，通过促进细胞的增殖、迁移、分化、存活、DNA修复以及诱导对活性氧具有解毒功能的酶的表达来加强上皮功能，从而保护上皮免于毒性物质的损伤(Finch，P.W.，et al.，Science，1989.245(4919)：p.752-5.；Rubin，J.S.，et al.V；Farrell，C.L.，et al.，Int J Radiat Biol，1999.75(5)：p.609-20.；Farrell，C.L.，et al.，Cancer Res，1998.58(5)：p.933-9.；Ellison CA，et al.，J Clin Immunol，2008，28(5)：600-615.)。

由Amgen公司开发的重组人角质形成细胞生长因子Palifermin(商品名Kepivance)是缺失人角质形成细胞生长因子I型的N末端23个氨基酸(Δ23hKGF)(Eric Hsu et al.，ProteinEngineering，Design & Selection vol.19 no.4 pp.147-153，2006)，于2004年被美国FDA批准用于治疗血液肿瘤患者高剂量化疗或者联合放疗导致的严重口腔粘膜损伤。Δ23hKGF在体内的半衰期仅为2hr，临床给药剂量大(60μg/kg/日)，需连续给药7天(1次/天)。

在治疗用蛋白质药物的研究中，解决蛋白类药物在机体内半衰期短的方法众多。其中最有效的方法之一是将蛋白质与水溶性聚合物共价结合成偶联物。而所使用的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚乳糖、聚合氨基酸等，其中聚乙二醇的使用最为普遍。

聚乙二醇-蛋白质偶联物具有良好的热稳定性、抗酶解、增加水溶性、延长体内半衰期、降低免疫原性和毒性等多重优点(Inada，et al.，J.Bioact.And CompatiblePolymers，5：343(1990)；Delgalo，et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriersystems，9：249(1992)；katre，Advanced Drug Delivery Systems，10：91(1993))。1991年第一种用聚乙二醇(PEG)修饰的药物PEG-ADA上市，近几年上市的产品有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生长抑素以及PEG-利巴韦林等。此外，尚有数十种PEG修饰的蛋白药物处于研究或临床实验阶段。