[发明专利]用真核表达系统制备泛素结合酶UbcH10的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于医学研究领域，特别涉及一种用真核表达系统制备泛素蛋白质降解系统中的泛素结合酶UbcH10的方法。

(二)背景技术

泛素结合酶UbcH10(Ubiquitin-conjugating enzymes UbcH10)又称周期蛋白选择性泛素载体蛋白E2-C，属于泛素结合酶E2家族的成员。在细胞周期调控过程中，UbcH10通过与具有E3连接酶活性的细胞后期促进复合物APC相互作用，影响有丝分裂纺锤体装配检测点驱动细胞周期的进展。在泛素介导的蛋白质降解途径中，E2蛋白的作用是通过其活性位点的半胱氨酸与来自E1活化酶的泛素以硫酯键相连，形成Ub-E2中间体，然后直接转移或通过E3连接酶转移泛素至靶蛋白，泛素化的靶蛋白被26s蛋白酶体识别而降解。泛素蛋白酶体系统(UP-S)具有多种生理调控功能，该系统功能失常能引起包括肿瘤在内的多种病例损害。Yoshiaki Okamoto等在研究泛素结合酶E2家庭成员对肿瘤发生的潜在作用时，指出UbcH10是肿瘤相关性泛素结合酶。

随着一些与泛素蛋白酶体途径相关致病蛋白的发现以及蛋白酶抑制剂Bortezomib(Velcade)对多发性骨髓瘤治疗调控的认可，特异性干涉UP-S的某一环节已被认为是一种很有前途的创新性抗肿瘤治疗方法。构建泛素结合酶UbcH10的真核表达载体，可为进一步了解其结构和功能奠定基础。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备容易、特异性高的用真核表达系统制备泛素结合酶UbcH10的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用真核表达系统制备泛素结合酶UbcH10的方法，主要包括如下步骤：

(1)从大肠癌组织中提取基因组总RNA，以此为模板通过RT-PCR(逆转录PCR)扩增泛素结合酶UbcH10，并将其构建至克隆载体pMD18-T中；

(2)通过EcoR I和HindI II双酶切构建成重组表达载体pcDNA3.1-UbcH10；

(3)重组质粒经酶切和序列测定后，转染大肠癌细胞株LoVo，进行Western-blot(蛋白质印迹)分析检测；

(4)经Western-blot分析表明构建的重组表达载体pcDNA3.1-UbcH10能在真核表达细胞中高表达UbcH10蛋白。

本发明所用的引物序列是根据Gen Bank中人UbcH10基因序列通过Primer5.0设计软件设计的特异性引物，上游引物(P1)序列为5’-GGAATTCAATGCTTCCCAAAACCGCG-3’，含EcoR I位点和起始密码子ATG；下游引物(P2)序列为5’-CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGGCTGGT-3’，含HindI II位点和双终止密码子TAA、TGA。

本发明实现了泛素结合酶UbcH10在真核表达系统的高特异性表达，为进一步进行泛素结合酶UbcH10与疾病的关系研究奠定了基础。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明pMD-UbcH10载体的构建示意图；

图2为本发明真核表达载体pcDNA3.1-UbcH10的构建示意图；

图3为真核表达载体pcDNA3.1-UbcH10中UbcH10的测序结果；

图4为UbcH10蛋白在转染细胞中的表达。

(五)具体实施方式

实施例：

从大肠癌肿瘤组织中提取基因组总RNA，通过PR-PCR扩增目的的基因泛素结合酶UbcH10，根据Gen Bank中人UbcH10基因序列通过Primer 5.0设计软件设计的特异性引物，上游引物(P1)序列：5’-GGAATTCAATGCTTCCCAAAACCGCG-3’，含EcoR I位点和起始密码子ATG；下游引物(P2)序列：5’-CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGGCTGGT-3’，含HindI II位点和双终止密码子TAA、TGA。扩增的目的基因片段大小为559bp，编码约179个氨基酸。PCR扩增的UbcH10片段与克隆载体pMD18-T连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含有氨苄抗性基因的LB琼脂平板筛选阳性克隆。