[发明专利]用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动子调控生产生物蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法。

背景技术

L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase EC 5.3.1.4)是由一系列微生物产生的、具有变构作用的酶。L-阿拉伯糖异构酶能催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖；由于L-阿拉伯糖和D-半乳糖结构的相似性，故L-阿拉伯糖异构酶也能催化D-半乳糖异构为D-塔格糖。D-塔格糖是甜味剂，具有低能量，降低血糖和抗龋齿等功能。虽然多种微生物具有产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，由于或是天然的产L-阿拉伯糖异构酶菌株的生长缓慢，营养要求较高，或是产物在胞内形成包涵体(细菌菌株)不利于目标蛋白的纯化，导致生产成本较高。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichiapastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型强启动子，与Pichia pastoris的pAOX1(醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要有毒性的甲醇作为碳源。

发明内容

本发明的目的是为解决应用天然产L-阿拉伯糖异构酶的菌株生产木糖异构酶的成本较高、产物难于纯化的问题，而提供一种用毕赤酵母pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，其步骤是：

1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；

2、在L-阿拉伯糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控L-阿拉伯糖异构酶基因的由G418抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418≥300μg/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含G418为≥300μg/mL的YPD(2％蛋白胨，1％yeast extract，2％葡萄糖)平板上；

3、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株(毕赤酵母的基因组中没有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生长；由于重组子含有G418抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生长。也就是说在G418抗性平板上能生长的就是重组子)；

4、将步骤3获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵1～2d分泌表达L-阿拉伯糖异构酶。所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L、CaSO₄·2H₂O 0.8～1.2g/L、K₂SO₄ 17～19g/L、MgSO₄·7H₂O 13～16g/L、KOH 3.5～4.5g/L、碳源15～45g/L、蛋白胨18～22g/L、Yeastextract 8～12g/L、PTM43～5ml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。所述PTM4是由以下组分组成：CuSO₄·5H₂O 2.0g/L、NaI·2H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 3.0g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L、H₃BO₃ 0.02g/L、CoCl₂·6H₂O 1.05g/L、ZnCl₂ 7.0g/L、Fe₂(SO₄)₃·7H₂O 22g/L、生物素0.2g/L、硫酸1ml/L。

本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶，具有下列优点：

1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。

2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以足够多的细胞数量表达L-阿拉伯糖异构酶，有利于L-阿拉伯糖异构酶的大规模生产。