[发明专利]一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，其特征在于：

由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品组成；

正向引物F_BCSP31：5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′；

反向引物R_BCSP31：5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′；

标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因的301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：

PCR反应液：由正反向引物F_BCSP31和R_BCSP31，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为：

5′-ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgc-3′。

4.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA提取液：包括如下组分：PBS(137mM Nacl，2.7mM Kcl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，PH7.4)，10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1MEDTA，pH 8.0)；

2)PCR反应液：由正反向引物F_BCSP31和R_BCSP31，10×PCR Buffer(含Mg2+)，dNTPs及无菌双蒸水组成；

3)标准阳性模板：含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒；

4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物FBCSP31：5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′

反向引物RBCSP31：5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′。

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

5.一种定性检测布鲁菌的方法，包括以下步骤：

1)样本的预处理，提取DNA；

2)将DNA和阳性标准品分别加入到反应液的PCR反应体系中，进行PCR检测；取PCR产物，以琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察301bp的扩增条带。