[发明专利]一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒无效
申请号: | 201010188839.4 | 申请日: | 2010-06-02 |
公开(公告)号: | CN101851679A | 公开(公告)日: | 2010-10-06 |
发明(设计)人: | 韩文瑜;杜涛峰;雷连成;孙长江;杜崇涛;冮森林;王大力;李铁峰 | 申请(专利权)人: | 吉林大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12Q1/04 |
代理公司: | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人: | 陈宏伟 |
地址: | 130062 吉林省长春市*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 检测 牛粪 样品 中布鲁菌 pcr 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及布鲁菌的检测分析技术,尤其公开了公开一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒,属于生物检测技术领域。
背景技术
布鲁菌病是由布鲁菌(Brucella)引起的一种全世界范围的人兽共患传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病。主要引起许多家畜和野生动物流产,人类通过食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接与感染动物或尸体接触而感染,临床上表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍、关节炎等非特异性症状。布鲁氏菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,传统上可分为6个种,即羊种布鲁菌(B.melitensis),牛种布鲁菌(B.abortus),猪种布鲁菌(B.suis),绵羊附睾种布鲁菌(B.ovis),沙林鼠种布鲁菌(B.neotomae)和犬种布鲁菌(B.canis)。其中,羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌是直接危害人类健康,严重困扰畜牧业发展的主要病原菌,给奶牛业造成巨大的经济损失。
目前,布鲁菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等,用常规方法分离鉴定病原条件要求苛刻,且费力、费时、危险性高、成功率低。RBT和SAT特异性不高、敏感性低;CFT操作繁琐,实验条件和技术水平要求高,实践应用极为不便。PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。在欧美的一些发达国家已经把PCR作为布鲁菌病病原诊断的一种工具。国内对于布鲁菌病的检疫诊断还相对比较落后,国内很多实验室建设仍然还是空白,对该病的检测仍然采用RBT、SAT和CFT,远不能满足实际需要。因此,开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。
发明内容
本发明公开了一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒,适用于牛粪便样品中布鲁菌定性检测。
本发明提供的快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒包括:
由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品组成;其中,
正向引物FBCSP31:5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′;
反向引物RBCSP31:5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′;
标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因的301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体,该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。
PCR反应液:由正反向引物FBCSP31和RBCSP31,10×PCR Buffer(含Mg2+),dNTPs及无菌双蒸水组成。
布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为:
5′-ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgc-3′
本发明所述试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)DNA提取液:包括如下组分:PBS(137mM Nacl,2.7mM Kcl,10mM Na2HPO4,2mMKH2PO4,PH7.4),10×TE(0.1M Tris-HCl,0.1M EDTA,pH 8.0);
2)PCR反应液:由正反向引物FBCSP31和RBCSP31,10×PCR Buffer(含Mg2+),dNTPs及无菌双蒸水组成;
3)标准阳性模板:含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒;
4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列:
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