[发明专利]甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种甜樱桃品种(系)自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法，尤其是一种适用于不同甜樱桃自交不亲和性(S基因型)品种(系)的鉴定、指导育种亲本的选择及其授粉品种的配置的SSR分子标记鉴定方法。

二、背景技术

甜樱桃(Prunus avium L.)属配子体型自交不亲和(Gametophyticself-incompatibility，GSI)，遗传上由染色体上具有复等位基因构成的单一位点或基因座控制(称为S基因座)，一个S基因座上，植物种群内可含有多个S等位基因(S alleles)，称之为S基因。甜樱桃品种大多数为自交不亲和品种，在生产中必须配置授粉树或人工辅助授粉，才能获得应有的产量和果实品质；因此使用甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法是十分重要。而目前在配置授粉品种时，常是依据田间不同品种间授粉坐果率的高低来确定授粉品种，这种方法虽直观有效，但不仅费时费力，盲目性比较大，而且由于人们对品种的S基因型不了解，使在选配品种时具有较大的盲目性，影响了提高樱桃品质。

如果知道品种的S基因型或能快速鉴定出品种的基因型，依据不同S基因型的品种间互相授粉结实，而相同S基因型的品种间授粉不结实原理，能正确选择授粉品种，对提高樱桃品质具有很大的意义。

甜樱桃品种S基因型鉴定是一项长期的应用基础性研究工作，随着新品种的不断育成和推广，需要探索出一套简易有效的方法来鉴定甜樱桃品种S基因型，这不仅能为研究甜樱桃自交不亲和性机理提供更有益的试材，而且能为生产确定最佳授粉品种提供依据。然而，从现有的鉴定方法而言，主要是用田间品种间相互授粉座果率高低来确定，虽然直观有效，但工作量大，周期长；生物技术方法虽然具有省工、快捷等优点，但要求相应的设备和技术条件，有一定的局限性，从而使甜樱桃品种S基因型鉴定进展缓慢。尤其在我国，樱桃生产者选用授粉品种时，多按传统的田间授粉率高低来确定，而对于通过鉴定品种的S基因型，选择具有不同S基因型品种作为授粉树科学性认识不足，是迄今我国樱桃新品种选育慢的主要原因之一。甜樱桃品种S基因型鉴定是一个极其薄弱而又急待加强的研究领域。

三、发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种甜樱桃品种(系)自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法，可提高自交不亲和基因型的检测效率，缩短了甜樱桃育种进程，节约了生产成本。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：

用PTCR4SSR标记，其SSR引物序列：

上游引物5′-CATAGGTTCAAACCATACCCGTG-3′

下游引物5′-CTCATCTTTGTAGGGTATAATACC-3′

扩增不同甜樱桃品种的DNA，可扩增出255bp的扩增片段，标志着花粉S基因存在，通过琼脂糖电泳检测获得电泳图；

根据琼脂糖电泳图，确定各品种(系)的自交不亲和基因型：相同谱带为同一S基因型，反之为不同S基因型。

本发明设计了，SSR扩增反应体系(25μL)中含有10×PCR buffer 2.5±0.25μL，2.5mmol·L^-1dNTPs 2.0±0.2μL，MgCl₂(2.5mmol·L^-1)2.0±0.2μL，1U Taq DNA聚合酶1±0.1μL，SSR上、下游引物(5pmol·μL^-1)1±0.1μL。

本发明设计了，SSR扩增反应体系(20μL)中含有10×PCR buffer 2.0±0.2μL，2.5mmol·L^-1dNTPs 1.6±0.16μL，MgCl₂(2.5mmol·L^-1)1.6±0.16μL，0.8U Taq DNA聚合酶0.8±0.08μL，SSR上、下游引物(5pmol·μL^-1)0.8±0.08μL。

本发明设计了，SSR扩增反应体系(15μL)中含有10×PCR buffer 1.5±0.15μL，2.5mmol·L^-1dNTPs 1.2±0.12μL，MgCl₂(2.5mmol·L^-1)1.2±0.12μL，0.6U Taq DNA聚合酶0.6±0.06μL，SSR上、下游引物(5pmol·μL^-1)0.6±0.06μL。