[发明专利]对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条

权利要求书

1.对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条，其特征是，

由底板(1)、固相硝酸纤维素膜，简称NC膜(2)、检测线即T线(3)、质控线即C线(4)、胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)、吸水纸(6)和样品垫玻璃纤维膜(7)组成；

底板(1)一端表面粘贴胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)，5mmx5mm；重叠胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)0.2cm粘上样品垫玻璃纤维膜(7)长2.5cm，NC膜(2)长1.8cm，粘贴在底板(1)表面中间段，此NC膜一端与玻璃纤维膜(5)重叠0.2cm，另一端与吸水纸(6)重叠0.2cm；底板(1)另一端表面粘贴吸水纸(6)，长3.0cm，NC膜(2)上划有一条鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体检测线T线(3)和一条羊抗兔IgG质控线C线(4)，检测线和质控线间距0.6cm。

2.权利要求1所述对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括：

(1)重组蛋白pET32a-VP1cr的制备与纯化

扩增VP1保守区基因VP1cr，构建高效表达载体pET32a-VP1cr，表达融合蛋白，用镍柱纯化包涵体蛋白；

(2)重组蛋白pET32a-VP1cr多克隆抗体制备及测定

常规方法制备重组蛋白pET32a-VP1cr多克隆抗体即兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体和鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体，该多克隆抗体效价分别为1∶102400和1∶25600，用Protein G亲和层析柱纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并调整为1mg/mL；

(3)胶体金-抗体结合物的制备和纯化

①调到pH8.2的20nm胶体金溶液20mL，在磁力搅拌下，缓慢加入浓度为1mg/mL的兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体至终浓度为15μg/mL，在室温下搅拌30min；

②加10％BSA牛血清白蛋白2mL至终浓度1％，室温搅拌5min；

③加10％PEG聚乙二醇20000 0.4mL至终浓度0.2％，室温搅拌5min；

④4℃，17000rpm，离心50min，弃去上清；

⑤沉淀溶于2mL保存液中，用0.45μm滤膜过滤，以上所得到的溶液为胶体金-抗体结合物原液，置4℃保存备用；胶体金-抗体保存液配制方法为：BSA 1g，PEG20000 0.05g，NaN₃0.1g，NaCl 0.8775g，用20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并定容至100mL，4℃保存备用，有效期6个月；

(4)胶体金-抗体结合物玻璃纤维膜的制备

进口玻璃纤维膜Ahlstrom8964剪成5mm×25mm，用20mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液将进口玻璃纤维膜漂洗三次，3min/次，去掉表面的杂质；然后，于干净平皿中放置两个白色枪头，将漂洗好的玻璃纤维膜小心放置在上面，37℃烘干，将胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物原液用20mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液进行1∶2倍稀释，然后吸取100μL均匀的喷在玻璃纤维膜上面，37℃吸附1h，制得胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜，4℃保存；

(5)抗体固相硝酸纤维素膜的制备

选择型号为Millipore 135的NC膜，将NC膜剪成1.8cm×2.5cm，用2μL的移液枪将鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体用包被液稀释浓度为2μg/cm在NC膜的一端划线作为检测线T线，在NC膜的另一端用包被液稀释过的浓度为1.6μg/cm羊抗兔IgG划线作为质控线C线，室温放置10min，待印上的抗体完全吸附于膜上后，将膜转移至盛有封闭液的平皿中，置于摇床中37℃，50rpm作用1h；然后，用20mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液漂洗三次，3min/次，置于37℃烘箱中干燥，4℃保存；

将已划线的硝酸纤维膜于24℃，相对湿度40％以下，真空干燥2h，铝箔袋密封，标明半成品批号，放置4℃保存；

包被液配制方法为：NaCl 0.85g，蔗糖4g，Tween-20 100μL，加入Tris-HCl缓冲液溶解并定容至100mL；封闭液配制方法为：BSA 3g，蔗糖4g，加入Tris-HCl缓冲液溶解并定容至100mL；

(6)组装

将PVC底板剪成2.5cm宽/条，先将印有抗体的NC膜小心平贴其上，再将胶体金-抗体结合物玻璃纤维膜重叠NC膜端2mm贴于划有T线的一端，然后重叠胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜2mm处平贴样品垫玻璃纤维膜，最后重叠NC膜端2mm在划有C线的一端贴上吸水纸，即为组装好的试纸板，再将组装好的试纸条放于两块玻璃平板间压紧后，用剪刀剪成5mm/条，密封干燥，4℃保存。