[发明专利]对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及对虾桃拉综合征病毒(TSV)胶体金检测试纸条，属于胶体金免疫检测技术领域。

背景技术

对虾桃拉综合征(Taura Syndrome，TS)是由对虾桃拉综合征病毒(Taura SyndromeVirus，TSV)感染引起的一种疾病，能在其主要宿主凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和细角对虾(P.stylirostris)中爆发流行和导致高死亡率。其感染凡纳滨对虾的累计死亡率为40％～100％。该病于1992年由厄瓜多尔研究人员在桃拉河口附近的凡纳滨对虾养殖场中发现，并以桃拉河地区命名了这种新的疾病，是世界动物卫生组织(OIE)必须要求申报的动物疫病。

目前，诊断TS和其病原TSV可行的方法包括：传统方法，免疫学方法和分子生物学的方法。传统的方法如：临床症状、组织病理学、动物实验。免疫学方法如：ELISA、免疫电镜等。分子生物学的方法如：探针，RT-PCR等。

在临床检测中，上述几种方法对该病毒的诊断均具有一定的意义。ELISA法较为成熟，但易出现非特异性；电镜观察法直观，但费用昂贵；RT-PCR法敏感、快速，但费用昂贵而且有设备限制。迄今为止，还未见有TSV免疫胶体金试纸条方法建立的报道。胶体金免疫试纸条与其他诊断方法相比较，体现出以下特点：①快捷迅速，可在5～15min内显示结果；②灵敏准确，结果受外因影响较小，可在对虾养殖场现场进行检测；③操作简单，不需要任何特殊仪器和设备，尤其适合在基层推广应用；④成本低廉，所需样本和试剂量少；⑤保存和运输方便，一般保存于4℃冰箱，甚至可常温保存；⑥安全稳定，胶体金无毒性，不造成环境污染，其胶体金颗粒与抗原是物理吸附不改变抗原的性质，可最大限度的保持抗原的活性。因此，研制TSV胶体金试纸条能更直观地诊断对虾桃拉综合征病毒，为该病的检测、检疫提供良好的工具。

发明内容

技术问题 本发明的目的是以多克隆抗体为基础，通过免疫胶体金标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测对虾桃拉综合征病毒的胶体金检测试纸条。

技术方案 本发明是以多克隆抗体为基础，通过免疫胶体金标记技术研制检测对 虾桃拉综合征病毒的胶体金检测试纸条。首先是TSV兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体和鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体的制备，纯化及胶体金标记，其次为划线，然后将试纸条各组成成分进行组装，最后对试纸条的特异性、敏感性、重复性、再现性、稳定性进行试验，最终制备检测对虾桃拉综合征病毒的试纸条。

对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条，其特征是，

由底板(1)、固相硝酸纤维素膜，简称NC膜(2)、检测线即T线(3)、质控线即C线(4)、胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)、吸水纸(6)和样品垫玻璃纤维膜(7)组成。

底板(1)一端表面粘贴胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)，5mmx5mm；重叠胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物玻璃纤维膜(5)0.2cm粘上样品垫玻璃纤维膜(7)长2.5cm，抗体固相硝酸纤维素膜，简称NC膜(2)，长1.8cm，粘贴在底板(1)表面中间段，此NC膜一端与玻璃纤维膜(5)重叠0.2cm，另一端与吸水纸(6)重叠0.2cm；底板(1)另一端表面粘贴吸水纸(6)，长3.0cm。NC膜(2)上划有一条鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体作为检测线T线(3)和一条羊抗兔IgG作为质控线C线(4)。

上述对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条的制备方法，包括：

(1)重组蛋白pET32a-VP1cr的制备与纯化

扩增VP1保守区基因(VP1cr)，构建高效表达载体pET32a-VP1cr，表达融合蛋白，用镍柱纯化包涵体蛋白。

(2)重组蛋白pET32a-VP1cr多克隆抗体制备及测定

常规方法制备兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体及鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗体，该多克隆抗体效价分别为1∶102400和1∶25600，用Protein G亲和层析柱纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并调整为1mg/mL。

(3)胶体金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗体结合物的制备和纯化