[发明专利]一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法

权利要求书

1.一种α-半乳糖苷酶，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型作用的蛋白质。

2.编码权利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

4.一种表达权利要求1所述α-半乳糖苷酶的方法，是将含有权利要求2所述α-半乳糖苷酶基因的编码序列插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的α-半乳糖苷酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述大肠杆菌为BL2l(DE3)、BL2l(DE3，plysS)，E.coli JM109，E.coli HB101或E.coli Topl0。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述α-半乳糖苷酶基因的编码序列插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体pET-22b-α-gal。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：转化有pET-22b-α-gal的重组大肠杆菌为pET-22b-α-gal/大肠杆菌BL2l(DE3)。

8.根据权利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于：所述对表达的α-半乳糖苷酶进行纯化的过程，依次包括超声破菌的预处理、阳离子纯化、阴离子纯化和超滤的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述对表达的α-半乳糖苷酶进行纯化的过程，具体包括以下步骤：

1)预处理：用Buffer A(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，25mM NaCl，pH5.0)悬浮菌体沉淀，超声破碎菌体，离心，取上清液用0.45um膜过滤；

2)阳离子纯化：将上清液上样至BufferA已经平衡的阳离子柱HistrapTM SP HP层析柱，用Buffer A洗涤，用Buffer B(20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，300mMNaCl，pH7.6)洗脱目的蛋白；

3)阴离子纯化：将洗脱蛋白调pH至8.6，再用水将样品稀释至NaCl浓度为60mM，上样至Buffer C(40mMTris-Hcl，10mMNaCl，pH8.6)平衡好的阴离子交换层析柱Hitrap Q^TM XL，接流出液及平衡液，测活有活性，保留；用Buffer C洗涤，用BufferD(40mMTris-Hcl，300mMNaCl，pH8.6)洗脱，测活无活性；

4)超滤：将流出液采用超滤的方法进行浓缩并更换缓冲液为酶解缓冲液(等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.8)，得到经纯化的α-半乳糖苷酶。

10.一种用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型血型转变的试剂盒，包含有权利要求1所述的α-半乳糖苷酶。