[发明专利]一种α-半乳糖苷酶及其表达、纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的酶及其纯化方法，特别是涉及一种细菌的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)及其表达、纯化方法。

背景技术

1900年，Landsteiner首次发现ABO血型系统并提出同型输血，为现代输血医学奠定了基础，Landsteiner因此获得1930年诺贝尔奖。1960年，Witkins证明ABH的抗原决定簇是糖类，这一发现加深了人们对血型的认识。近二十多年来，通过运用其它学科先进的分析方法，输血医学得到长足发展，在保障人民生命安全中发挥了巨大作用。然而，输血安全和血液偏型仍是摆在我们面前的两大难题。长期以来，因血型鉴定错误、识别错误等主客观因素引起的错误输血发生率居高不下，在科技发达的美国，错误输血发生率达1例/1.2万单位之多，其中，ABO血型不合的错误率为1例/3.3万单位，死亡率约1例/80万单位，是输血死亡的首要原因，比输血传播疾病(如HIV、HBV等)发生率(1例/200万单位)高得多。由于目前红细胞的保存期仅6周，在遇到长节假日、寒暑假等情况时采血量大大减少，很容易出现某种血型RBC供应告急而其它型RBC过剩甚至过期以至浪费的偏型现象。血液偏型不仅危及需要输血患者的生命安全，还造成巨大的浪费，美国统计达6％之多，这对本来就不充裕的血源来说无疑是雪上加霜。

人类红细胞血型系统至少有29种，以ABO和Rh血型系统对输血安全最为重要。O型RBC不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、B、AB或O型的受血者，因此又被称为“通用型RBC”。应用通用型RBC可以极大的降低因ABO血型不合所致的输血反应，提高输血的安全性；解决血液偏型难题、减少血液浪费；简化血液采集、储存和配型程序，提高血站和医院输血科的工作效率，输血成本可节省近9％，据报道美国每年可节约7亿美元，保守估计我国每年可节约3亿元。美国红十字会血液中心科学主管Garratty预计未来几年内有望将A、B或AB型RBC转变成O型，届时将只储存和使用O型RBC，这将是输血医学的一场革命。此外，在战争、恐怖袭击、巨大灾难和其它突发事件中，及时安全的输血是救治伤员的一个关键因素。应用通用型RBC时，无需检查受血者的ABO血型，使用简便、迅速、安全，可增强应急输血保障能力，提高伤员的存活率。

ABH血型抗原的本质为糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖链的种类及排列顺序决定的。O型RBC仅表达H抗原；B型RBC仅含B抗原，B抗原非还原端比H抗原多一个α-1，3半乳糖；A型RBC较为复杂，主要分为A1和A2两种亚型。在A1亚型红细胞上含有A和A1抗原，而A2型红细胞上仅含有A抗原。A2亚型RBC表面的人抗原比H抗原多一个α-1，3-N-乙酰半乳糖胺，而A1亚型RBC表面的A1抗原比A抗原多一个N-乙酰半乳糖胺α1→3(岩藻糖α1→2)半乳糖[GalNAcα1→3(Fucα1→2)Gal]三糖结构，我国A1亚型占A型99％以上；AB型RBC则含有A、B两种抗原。

糖苷水解酶酶解法是目前实现通用型红细胞的最有前途的方法。糖苷水解酶存在广泛，种类丰富。国际生物化学和分子生物学联合会根据作用机制和酶切底物分类，已正式命名了150多类糖苷水解酶。这些糖苷水解酶部分来自高等动物、酵母、黑曲霉等，这些酶都是溶酶体酶，最适pH一般都在3.5-4.5之间，酶比活性一般不超过50U/mg，反应需要高浓度的酶蛋白(＞3mg/mL)和低pH值，酶解不完全，不能满足血型转变要求。部分糖苷水解酶来源于产气荚膜梭菌、沙门氏菌、肺炎球菌、双歧杆菌、空肠弯曲杆菌、黄杆菌、粪球菌等微生物中。α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)可分别将B抗原非还原端的α-1，3半乳糖酶切，生成O型红细胞表面的H抗原。

国外文献(Liu QP，Sulzenbacher G，Yuan HP，et al.Bacterial glycosidasesfor the production of universal red blood cells[J].Nat Biotechnol，2007，25(3)：454-464.)提供了一种α-半乳糖苷酶，其来源于脆弱类杆菌，氨基酸残基序列为605个氨基酸，编码基因在基因库中登录序列号为AM109954.1(由1818个脱氧核苷酸组成)。该工具酶具有酶解B型红细胞功能，但酶比活仅为0.3U/mg。

发明内容

本发明提供了一种可用于将人红细胞血型由B型转变为O型、由AB型转变为A型的高活性的α-半乳糖苷酶。