[发明专利]一种放射性铼标记人纤溶酶原kringle5蛋白及其制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及一种放射性标记蛋白及其制备方法以及该放射性标记蛋白的应用。

【背景技术】

目前国际上以肿瘤血管为靶点的药物已有多种，许多已进入临床试验或者被批准临床应用。如Endostatin(内皮抑素)已于2005年被FDA批准进入临床；Angiostatin(血管抑素)也已进入临床试验I期。

Cao等已发现重组人纤溶酶原Kringle 5(Recombinant HumanPlasminogen Kringle5，rhk5)作为肿瘤血管生成抑制剂，活性等各方面优于上述药物，具有潜在的应用价值。

核素标记血管生成抑制剂可通过β射线达到增强肿瘤靶向治疗的效果，降低肿瘤血管生成抑制剂的用量，降低成本。目前国外已有类似研究，如Yang等使用^99mTc标记Endostatin的实验研究显示肿瘤可以清晰显像；Lee等使用¹²³I标记的Agiostatin取得了同样的效果。

目前尚未见采用具有优良理化性质的放射性核素¹⁸⁸Re标记具有更强肿瘤血管抑制作用的rhk5的研究、特别是治疗的研究报道。Endostatin及Angiostatin等若要达到治疗效果需持续给药，且费用昂贵。^99mTc标记Endostatin的实验研究显示肿瘤可以清晰显像，但不能用于治疗；Lee等使用¹²³I标记的Agiostatin取得了同样的效果，但标记不稳定。核素直接标记蛋白常会造成蛋白活性的损伤。

【发明内容】

本发明的第一个目的是提供一种高效的抗肿瘤药物¹⁸⁸Re-rhk5，即核素¹⁸⁸Re标记的重组入纤溶酶原Kringle 5蛋白。

本发明的第二个目的是提供¹⁸⁸Re-rhk5的制备方法。

本发明的第三个目的是提供¹⁸⁸Re-rhk5在抑制肿瘤生长中的应用。

为实现上述目的，本发明公开以下技术方案：

一种核素标记rhk5蛋白，其特征在于，所述核素为¹⁸⁸Re。

¹⁸⁸Re-rhk5的制备方法，包括步骤(1)和步骤(2)：

步骤(1)rhk5蛋白的表达，形成羧基端连接6×His·Tag的融合蛋白，可以优选通过下述两种方式获得：

将Kringle 5基因片段构建入原核表达载体质粒pET-22b(+)→氨基端加入信号肽序列→羧基端加入6×His序列→当pET-22b(+)-k5在BL21-CodonPlus感受态菌被诱导后，在rhk5氨基端表达信号肽段，并在氧化环境下形成二硫键，同时切除信号肽，形成羧基端连接6×His·Tag的融合蛋白。

或者，将Kringle 5基因片段构建入真核表达载体质粒pFastbacl→羧基端加入6×His序列→当pFastbacl-rhk5在27℃培养的昆虫sf9细胞内孵育后，以可溶性方式表达rhk5蛋白，并在氧化环境下形成二硫键，形成羧基端连接6×His·Tag的融合蛋白。

步骤(2)三羰基铼标记rhk5的核心步骤：

1)取5mg BH₃·NH₃放入干燥西林瓶中，加盖密封，通CO气体约20min。

2)在1mL¹⁸⁸ReO^4-的生理盐水淋洗液中，加入7μL浓H₃PO₄。

3)混匀后注射到已通好CO的西林瓶中，70℃水浴加热15min。

4)测定反应后生成的中间体fac-[¹⁸⁸Re[(CO)₃(H₂O)₃]⁺的螯合率。

5)三羰基铼标记rhk5，优化后的标记条件为：rhk520μg，加入0.1mL¹⁸⁸ReO^4-淋洗液，调节溶液的pH值为5.0，充分混匀后，置50℃水浴中温育1h。