[发明专利]一种通过实时监测细胞内吞研究抗癌药物的方法

权利要求书

1.一种实时监测细胞内吞过程的方法，其包括以下步骤：

1)加入抗癌药物，使其作用于待测细胞；

2)通过两步标记法，在待测细胞的细胞膜上连接表皮生长因子-量子点探针；

3)采用荧光显微镜，在光强小于100μW条件下进行观测并拍摄，根据量子点标记来追踪细胞内吞过程；

4)定量分析拍摄数据，得到相对内吞曲线。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤1)中的作用于待测细胞的抗癌药物浓度为100nM-4μM，作用时间为2-18小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述步骤2)中的两步标记法包括以下步骤：

a)将10-50nM浓度的表皮生长因子-生物素结合体溶液加入至经步骤1)处理的待测细胞中，在冰浴下培育5-10min后吸出溶液，并用培养液冲洗；优选地，所述培养液为4℃无酚红的DMEM培养液；

b)将0.1-1nM浓度的量子点-链霉亲和素结合体溶液加入步骤a)处理后的待测细胞中，冰浴培育1-5min后，吸出溶液，并用缓冲液冲洗；优选地，所述缓冲液为4℃的PBS缓冲液；

c)将培养液加入步骤b)处理后的待测细胞中作为观测液；优选地，所述培养液为无酚红的DMEM培养液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述步骤3)中将细胞放置在荧光显微镜载物台上的37℃二氧化碳培养室进行观测。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述步骤3)中用荧光显微镜进行观测的方法为快门和CCD曝光同步，每帧150ms曝光，间隔1秒，持续60min。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下的数据处理方法：

a)找到每帧图片中的光点的位置坐标并记录；

b)画出细胞轮廓线，记录轮廓线坐标，并设细胞核中心为点O；

c)求出每帧图片中的光点相对于点O的距离的平均值S，细胞轮廓线的各坐标相对于点O的距离的平均值L，计算出每帧S/L的值，将其定义为相对内吞距离；

d)将帧数换算为时间，以相对距离和时间作图，即得到相对内吞曲线。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中的待测细胞为癌细胞，优选选自人肺癌细胞、人宫颈癌细胞和人皮肤鳞癌细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中的抗癌药物为以微管为靶点的抗癌药物，优选选自秋水仙素、长春碱、诺考达唑和紫杉醇。

9.权利要求1至8中任一项所述方法在实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程中的用途。

10.一种实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1至8中任一项所述方法实时监测细胞内吞过程。