[发明专利]一种通过实时监测细胞内吞研究抗癌药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种通过实时监测细胞内吞研究抗癌药物的方法。

背景技术

随着生命科学研究的快速发展，生物荧光技术在细胞免疫学、分子生物学、肿瘤学等方面的应用越来越广泛。荧光技术已经成为生命科学研究的重要手段之一。但是传统的荧光探针如绿色荧光蛋白(GFP)、Alexa Fluro、Cy3、Cy5等有一些无法克服的缺点，比如会有不同程度的荧光淬灭，光强不稳定，无法应用于长时间观测实验。然而许多生命过程是一种长时间，持续性的变化，所以需要一种稳定性好的荧光探针。

量子点(quantum dots，QDs)又可称为半导体纳米微晶体，是一种稳定的、可溶于水的、尺寸为2-20nm的纳米晶体。作为一种新型的荧光材料，与传统的有机染料分子相比，量子点具有多种优势，例如激发光谱宽，稳定性好，发光寿命长等。正是由于其优良的光谱特征和光化学稳定性，量子点已经被应用于活细胞成像观察，并在生物化学，分子生物学，基因组学，生物大分子相互作用等研究中有极广的应用前景。

很多抗癌药物都是以细胞骨架为靶点，如秋水仙素、紫杉醇等。这些药物让细胞的微管解聚，或者促进微管聚合并使其在细胞内聚集。这样干扰了微管的功能，从而阻断细胞的分裂，以治疗癌症。但是微管的功能不仅是帮助细胞完成有丝分裂，同时还是细胞内吞输运的重要通道。其中一个重要的方面就是细胞膜上受体介导的内吞过程，比如EGFR(表皮生长因子受体)。此外，抗癌药物对细胞内吞功能的影响也是衡量其药效的一个重要方面。

目前对细胞内吞的研究策略是在的不同时间点来拍照取数据，通过几个时间点的静态图片来找到抗癌药物的影响，多是定性结论，且不是针对某一个特定细胞的。这样的结果进行横向比较时，其可信度降低，更重要的是，无法得到内吞输运的全面、动态、实时可见的数据。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种实时监测细胞内吞过程的方法。

本发明的另一个目的是提供上述方法在实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程中的用途。

本发明的又一个目的是提供一种实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种实时监测细胞内吞过程的方法，其包括以下步骤：1)加入抗癌药物，使其作用于待测细胞；2)通过两步标记法，在待测细胞的细胞膜上连接EGF-QD(表皮生长因子-量子点)探针；3)采用荧光显微镜，在光强小于100μW条件下进行观测并拍摄，根据量子点标记来追踪细胞内吞过程；4)定量分析拍摄数据，得到相对内吞曲线。

优选地，其中所述步骤1)中将抗癌药物用细胞培养液DMEM稀释到工作浓度100nM-4uM后，加入生长待测细胞的培养皿中，并在培养箱中放置相应的时间，一般2-18小时。

优选地，其中所述步骤2)中的两步标记法包括以下步骤：a)吸出培养皿中的原培养液，将10-50nM浓度的biotin-EGF(表皮生长因子-生物素结合体)溶液加入至培养皿中，并在冰浴下培育5-10min后吸出biotin-EGF溶液，并用4℃无酚红的DMEM培养液冲洗3遍；b)将0.1-1nM浓度的streptavidin-QD(量子点-链霉亲和素结合体)溶液加入至步骤a)处理后的待测细胞的培养皿中，冰浴培育1-5min后，吸出steptavidin-QD溶液，并用4℃的PBS缓冲液冲洗；c)将无酚红的DMEM培养液加入至步骤b)处理后的待测细胞的培养皿中作为观测液。

优选地，其中所述步骤3)中的光强及拍摄参数调节如下：在荧光显微镜汞灯后加光强衰减片，以使物镜出射光强小于100μW，保证细胞在长时间的激光照射下不会受影响。另调节控制激发光快门的打开时间，与CCD曝光时间同步以进一步减少激光对细胞的损害。安全范围是每次曝光时间150-300ms，每帧拍摄间隔1-3秒。将细胞放置在荧光显微镜载物台上的37℃二氧化碳5％培养室进行观测。

优选地，其中所述步骤4)定量分析录像数据包括以下步骤：a)找到每帧图片中的光点的位置坐标并记录；b)画出细胞轮廓线，记录轮廓线坐标，并设细胞核中心为点O；c)求出每帧图片中的光点相对于点O的距离的平均值S，细胞轮廓线的各坐标相对于点O的距离的平均值L，计算出每帧S/L的值，将其定义为相对内吞距离；d)将帧数换算为时间，以相对距离和时间作图，即得到相对内吞曲线。相对内吞曲线的变化范围即说明了内吞过程的相对大小。