[发明专利]农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法

权利要求书

1.农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤：

(1)制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；

(2)共培养后的外植体接入筛选培养基进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；

(3)分化出不定芽；以及

(4)生根培养，从而获得转基因植株。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(1)步骤中，共培养所用培养基含有50-200μM乙酰丁酰酮。

3.如权利要求2所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(1)步骤中，共培养采用C13A固体培养基，其含有1.0-3.0mg/L

6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200μM乙酰丁酰酮的MS培养基；麻风树外植体的制备经由以下工艺：挑选麻风树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，于MS培养基萌发，获得子叶，切制成外植体；农杆菌菌液是用C 13A液体培养基重悬浮离心收集的农杆菌体制得。

4.如权利要求3所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(1)步骤中，获得麻风树外植体工艺中，接种于MS培养基萌发，是将接好的材料先暗培养2-4天，然后光照培养10-12天，种子萌发的培养条件是，温度23-26℃，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000lx；所述第(1)步骤中，农杆菌菌液的准备、浸染及共培养，进一步包括以下工艺步骤：

(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养20-24小时，然后按照1∶100转接，震荡培养至对数生长期，OD600＝0.8-1.0，将菌液转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆菌，调至OD600＝0.3-0.6，28℃震荡培养1-2个小时，备用；

(b)将切好的叶片放入容器中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速震荡5-15分钟；以及

(c)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入C13A固体培养基，置于23-26℃黑暗共培养2-4天。

5.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(2)步骤的筛选培养基为C13PC培养基，其含有1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基。

6.如权利要求5所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(2)步骤进一步包括以下工艺步骤：

(a)取出共培养后的外植体，放入容器中，加入无菌水洗后，用含250-500mg/L头孢霉素的无菌水洗；

(b)洗过的外植体放在滤纸上，吸去多余的水，接入筛选培养基C13PC，所述筛选培养基C 13PC是指MS培养基含1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L

3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠，2-3％蔗糖，0.7％琼脂，以及pH5.8-6.0)；以及

(c)置于23-26℃暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织。

7.如权利要求1所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(3)步骤，是将获得的抗性愈伤组织，转入分化培养基SR13PC进行培养，该分化培养基含1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素。

8.如权利要求7所述的农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，其特征在于：所述第(3)步骤的分化培养基为SR13PC培养基，是MS培养基含0.25-2.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.1-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，0.01-0.2mg/L赤霉素，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢霉素，20-30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5.8-6.0；接好的抗性愈伤组织在23-26℃，光照培养10-60天即可得到不定芽，培养条件为，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000lx。