[发明专利]农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及麻风树的组织培养技术领域及基因工程领域，尤其是指农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，从而获得转基因植株。

背景技术

麻风树(Jatopha curcas)，又名小桐子、柴油树，为大戟科麻风树属，多年生落叶灌木或小乔木，分布于热带和亚热带地区。它为喜光阳性植物，根系粗壮发达，具有较强的耐干旱瘠薄能力，可以种植在其他植物不易生长的土地上，是干旱地区理想的造林树种。麻风树种仁含油量高达50％～60％，可以提炼出不含硫、无污染、符合欧四排放标准的生物柴油，是世界公认的生物能源树；也可作药用，常用于清热解毒，消肿散瘀等；近年来的研究发现，该植物还具有显著的抗癌活性。因此麻风树具有广泛的开发利用价值。

目前，我国在麻风树育种方面的工作才刚刚开始。由于麻风树多为野生状态，又为木本植物，采用常规育种来改变其遗传性状十分困难。因此，采用现代生物技术手段，如转基因技术进行辅助育种成为首选。植物转基因技术的前提是高效的离体再生系统。近些年来，麻疯树组织培养技术也获得成功，采用的外植体有种胚、子叶、上胚轴、下胚轴、叶柄、叶片，胚乳，花药，甚至老龄树(20年以上)长出的幼嫩茎段，然而再生频率有待进一步提高。

植物转基因技术因能主动导入外源基因，定向改造植物性状日益受到人们的重视。植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表；另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法。以根癌农杆菌介导的植物遗传转化是目前最有效的途径之一。然而，由于麻风树的遗传转化研究起步较晚，因此，对麻风树进行遗传改良，通过导入外源基因，对其进行定向性状改造，具有十分重要的经济价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，解决现有育种技术无法遗传改良的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法，包括以下步骤：

(1)制备麻风树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；

(2)共培养后的外植体接入筛选培养基C13PC进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基C13PC是含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；

(3)分化出不定芽；以及

(4)生根培养，从而获得转基因植株。

所述第(1)步骤中，共培养优选采用C13A培养基含有50-200μM乙酰丁酰酮。

所述第(1)步骤中，共培养采用优选采用C13A固体培养基，其含有1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200μM乙酰丁酰酮的MS培养基；麻风树外植体的制备经由以下工艺：挑选麻风树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，于MS培养基培养，获得子叶，切制成外植体；农杆菌菌液是优选采用C13A液体培养基重悬浮离心收集的农杆菌体制得。

所述第(1)步骤中，获得麻风树外植体工艺中，接种于MS培养基萌发，是将接好的材料先暗培养2-4天，然后光照培养10-12天，种子萌发的培养条件是，温度23-26℃，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000lx。

所述第(1)步骤中，农杆菌菌液的准备、浸染及共培养，进一步包括以下工艺步骤：

(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养20-24小时，然后按照1∶100转接，震荡培养至对数生长期，OD600＝0.8-1.0，将菌液转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，用C13A液体培养基重新悬浮农杆菌，调至OD600＝0.3-0.6，28℃震荡培养1-2个小时，备用；

(b)将切好的叶片放入容器中，加入准备好的菌液，置于摇床慢速震荡5-15分钟；以及

(c)取出浸染过的材料，倒掉菌液，将叶片放在滤纸上，吸去多余的菌液，接入C13A固体培养基，置于23-26℃黑暗共培养2-4天。

所述第(2)步骤的筛选培养基C13PC是优选采用含有1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基。

所述第(2)步骤进一步包括以下工艺步骤：