[发明专利]一种筛选鉴定粘附蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选鉴定蛋白的方法，尤其涉及一种筛选鉴定粘附蛋白的方法。

背景技术

微生物之间以及与环境(宿主)相互作用的研究是当今微生物学领域的核心研究方向。近年来，肠道菌群在肠道内的定植、繁衍机制已引起广泛的关注，尤其是其特殊的遗传特性、分泌具有潜在生物学意义的蛋白质和生物活性物质，在肠道环境中的适应性，及与宿主细胞(肠上皮细胞)的相互作用机理错综复杂。在物质/信号的传导、应对内外环境的变化以及致病菌的侵染方面依然存在科研的盲点，微生物与宿主相互作用的分子机制一直是研究的热点和难点。肠道微生物在长期的进化过程中存在菌株的适应性，表现为不同菌株在粘附、拮抗、免疫刺激等生物学作用的差异性，而这些差异性导致在寻找这些功能成份参与粘附和定植作用的研究中缺乏一个通行的方法。粘附肠黏膜上皮细胞的强弱是益生菌和致病菌定植机体、发挥生理作用的重要前提，也是目前筛选重要益生菌菌种资源、降低致病菌侵袭性的重要指标。目前，学术界一致认为粘附是由胞壁中脂磷壁酸、肽聚糖及细菌表面粘附蛋白等粘附素参与或介导的与宿主细胞表面受体相结合的过程，其中蛋白在粘附和入侵过程中扮演着重要的角色。

筛选粘附蛋白、验证其粘附肠上皮细胞作用是一个非常繁琐的过程，存在两种不同的研究策略。一种是多数研究采用的，先寻找粘附物质，再分离纯化出蛋白，如Bernet等(1993)用电镜观察到双歧杆菌的黏附发生在Caco-2细胞的刷状缘上，且粘附素为某种存在于细菌细胞壁及耗尽培养液中的热敏性蛋白物质。Fujiwara(1997)首次采用薄层色谱法经一系列的凝胶分子筛分离后通过测定与神经节四己糖基神经酰胺的结合，得到双歧杆菌发酵上清中的粘附蛋白BIF，该方法涉及放射性元素标记、凝胶分子筛、神经节四己糖基神经酰胺薄层色谱板的制备，不仅实验周期长、操作繁琐，还对自身健康造成不利影响。2008年Guqlielmetti首次发现两歧双歧杆菌MIMBb75的脂蛋白Bop A，它是一个ABC转运系统中寡肽或三肽结合蛋白，参与了双歧杆菌的粘附过程。这种策略存在分离纯化工作量大、费时、效率低等缺点。近年来，随着微生物全基因组序列的陆续公布，另一种策略也应运而生，即利用生物信息学分析预测粘附蛋白特征序列，采用粘附蛋白开放阅读框预测法直接表达猜想的粘附蛋白，再经细胞粘附实验确证其粘附性能，如Jakava等(2007)采用此法筛选获得对Henle 407细胞有较强粘附力的乳酸菌表面蛋白。然而由于粘附蛋白特征序列目前仍未确证，加之肠道环境的复杂性，经过推测得到的蛋白相当一部分不具有粘附功能，因此这种策略带有一定的盲目性。

本方法将蛋白质技术、细胞培养与分子免疫方法相结合，利用磁珠建立有效的高通量筛选粘附蛋白的方法，是对研究肠道微生物和肠上皮细胞相互作用的一种思路创新，目前分离粘附蛋白的方法多数只能得到一种粘附蛋白，而通过生物信息学的方法筛选粘附蛋白假阳性率高。本方法拟通过活泼酯法把肠上皮细胞碎片形成肽键与磁珠共价偶联，模拟肠粘膜的表面，多糖、蛋白和脂类这些可能的粘附受体都尽可能保持完整，固定并呈现于磁珠表面，再与蛋白样品共孵育，利用磁珠的磁性一次性高通量把所有可能参与粘附的蛋白分离出来。

本方法将有助于建立粘附蛋白筛选平台，挖掘具有粘附和免疫作用的益生菌生物资源，探索致病菌致病机理，这对于当前研究益生菌、致病菌与宿主细胞的粘附定植机制的研究起到促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选鉴定粘附蛋白的方法，该方法具有高效高通量的优点，适于多种微生物粘附蛋白的筛选和鉴定。

本发明是这样来实现的，采用磁珠法筛选益生菌粘附蛋白，其特征是方法步骤为：羧化表面的磁珠经碳二亚胺和硫代羟基琥珀酰亚胺处理后，与肠上皮细胞碎片共价偶联形成酰胺键，洗涤干净磁珠后，与益生菌表面蛋白溶液共孵育1h后，PBS缓冲液洗3遍，除去未粘附的表面蛋白，采用50mM、pH 2.3的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱粘附蛋白，SDS-PAGE后质谱测序，鉴定此粘附蛋白。

磁珠法筛选致病菌粘附入侵相关蛋白，方法为：将肠上皮细胞碎片经活泼酯法偶联将肠上皮细胞碎片经活泼酯法偶联至磁珠上，处理过的磁珠与致病菌蛋白样品共孵育1h后，PBS缓冲液洗3遍，除去未粘附的蛋白，采用50mM、pH 2.3的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱粘附蛋白，SDS-PAGE后质谱测序，鉴定此粘附蛋白。