[发明专利]48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法

权利要求书

1.48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤：

(1)细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与48种致敏的脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；

(2)筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；

(3)单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，分别与48种恶性肿瘤标志物抗原进行特异性和效价筛选。

(4)单克隆抗体纯化保存：将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。

(5)CY3标记抗体：用CY3荧光素标记补体C3抗体。

(6)48种恶性肿瘤标志物单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0.01-1ng/ml。

2.根据权利要求1所述的48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与48种致敏的脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(6)恶性肿瘤标志物单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点48个点，检测线性范围0.01～10ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成：

a、包被：

以50mmol/L、pH＝9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的48种恶性肿瘤标志物每一种1∶500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存备用。

b、封闭：

每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200μl洗涤、内含1％山羊血清；

c、加样：

每孔加入细胞融合后7天的细胞培养上清液50-100μl(1∶5000-10000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；

d、加入酶标二抗每孔100-200μl，洗涤；

e、显色：

每孔加入底物50-100μl；

f、比色：

以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D)；

g、结果判断：P/N＝测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N≥2.1为阳性。

4.根据权利要求3所述的48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤c中的工艺条件为每孔加入1∶5000-10000稀释后的细胞融合后7天的细胞培养上清液50-100μl，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为37℃、时间为1小时，洗涤3次。

5.根据权利要求1所述的48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1∶10-100的比例混合，30-60秒内逐渐加入45％PEG(分子量：4000)，静止90-120秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml1640培养液；间隔2分钟滴加5ml1640培养液，然后加1640培养液至50ml，1500rpm/分钟离心10分钟，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)按20-50％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。