[发明专利]48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法

背景技术

本项目主要应用与在食管癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃转移癌等恶性肿瘤相关蛋白领域创立抗体芯片检测技术平台，自主研发48种恶性肿瘤标志物抗体芯片检测试剂盒(抗体芯片)完全是由中国人自主开发，应用这一芯片，可通过多种方式、多种渠道、多层面检测恶性肿瘤标志物的效价和含量，将检测灵敏度由ug提高到ng级，从而达到更准确、更全面的效果，其检测结果可指导临床治疗。48种恶性肿瘤标志物抗体芯片检测试剂盒(抗体芯片)对促进我国生物高技术前沿领域的发展具有重大鼓舞作用，对提升我国生物芯片技术、产品和市场的国际竞争力具有重大意义，此方法完全符合分子免疫学原理。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用及进行药物产品的定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法。

本发明的整体技术构思是：利用细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验进行特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人恶性肿瘤标志物单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于芯片的点样，结合CY3标记的补体C3抗体与被检产品建立了完整的检测系统，检测48种恶性肿瘤标志物蛋白质含量的方法。此抗体芯片具有灵敏度高，特异性好、操作简单、高通量等优点，可用于临床和体检血清的监测和质控。

48种恶性肿瘤标志物抗体芯片的制备方法，它包括如下工艺步骤：

(1)细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞分别与48种致敏的脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；

(2)筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；

(3)单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，分别与48种恶性肿瘤标志物抗原进行特异性和效价筛选。

(4)单克隆抗体纯化保存：将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。

(5)CY3标记抗体：用CY3荧光素标记补体C3抗体。

(6)48种恶性肿瘤标志物单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0.01-1ng/ml。

本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是：

步骤(1)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1∶10的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36％的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。

步骤(2)中是将细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

步骤(3)中采用酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，分别与48种恶性肿瘤标志物抗原进行特异性和效价筛选。

步骤(4)中将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。

步骤(5)中选用的是CY3对补体C3抗体的标记

步骤(6)中采用48种恶性肿瘤标志物单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0.01-1ng/ml。