[发明专利]基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米技术领域的检测方法，具体说是一种基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法。

背景技术

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还需要借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸、及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。作为一种操作简单、检测快速、结果可靠的组织样本中蛋白检测方法，免疫组化正越来越多的地应用于医学研究及临床诊断中。

用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，目前常用的荧光素多是有机染料，存在荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定的限制。

量子点(QDs)特指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒，由于其具有发射光谱窄且具有尺寸“调谐”特性，用单个波长即可激发不同的量子点，荧光量子产率高，稳定性好，很好的生物相容性等优点，在生物医药标识方面，量子点巨大的研究和应用价值逐步被看好。通过将量子点连接在抗原或者抗体上，形成量子点标记的抗原(抗体)复合物，借助于组织化学方法直接进行显色反应，可以显示细胞或组织中的化学成分，在荧光显微镜下可清晰看见细胞内或者组织中发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布及其含量。另外，量子点宽的吸收峰和窄的吸收峰使得在一个简单的系统中进行多色多通道分析检测成为可能。

量子点基础上的免疫组化分析方法，具有以下有点：光稳定性增加，高灵敏度，与现有化学发光比较灵敏度高或者相当；线性强，提高蛋白表达量；与现有的成像系统相容，不用专用设备；节约实践和成本；多色检测，可以在同一个检测窗口观测到多个抗体的存在并决定他们的浓度，比单色检测降低成本。用量子点标记的免疫组化检测方法，可以大大加速并且提高检测的灵敏度和分析的准确度。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法。本发明的方法用荧光显微镜直接进行观察判断，省去了染色、复染、脱水、透明等操作，更简单易行，节约时间和成本；而且荧光光稳定性增加，与现有免疫组织化学显色方法相比较，分析的准确度和检测的灵敏度有所提高。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，将表面带有羧基或氨基的水溶性量子点与非洲猪瘟单克隆抗体连接

(1)如果是表面带有羧基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在硼酸盐缓冲溶液中，然后加入硫化二亚胺和单克隆抗体，混合，25℃下反应3小时，离心，洗涤，得到量子点标记的单克隆抗体复合物；其中，量子点∶硫化二亚胺∶单抗的摩尔比为60∶15∶1；

(2)如果是表面带有氨基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在含有体积分数为1.25％的戊二醛的磷酸缓冲溶液中，超声使之完全分散，25℃下摇床活化反应3小时，加入单抗，在4℃下反应24小时，离心，洗涤，得到量子点标记的单抗复合物；其中，量子点∶戊二醛∶单抗的摩尔比为60∶15∶1；

步骤二，将切片标本先放入二甲苯中脱蜡2次，然后置入无水乙醇中梯度水化，水洗，过氧化氢灭活内源性过氧化氢酶，微波抗原修复，水洗后用BSA封闭，4℃反应过夜，磷酸缓冲溶液洗后加入量子点标记的非洲猪瘟单克隆抗体复合物，避光条件下37℃反应30-60分钟，磷酸缓冲溶液漂洗，甘油封片；磷酸缓冲溶液替代抗体复合物作为阴性对照，在荧光显微镜下观察样本。

步骤一中，所述硼酸盐缓冲溶液的PH为8.32。

步骤一中，所述磷酸缓冲溶液的PH为7.2。