[发明专利]重组人表皮生长因子工程菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及表皮生长因子工程菌的构建方法。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的多肽，分子量约为6000Da。EGF(表皮生长因子)的生物学功能使其在制药和化妆品领域具有广泛的应用。EGF能刺激多种细胞生长，抑制胃酸分泌，因而可用于创伤和消化性溃疡的治疗，还能用于化妆品领域，具有护肤、抗皱、美白等作用，因此获得大量具有生物活性的EGF尤为必要。hEGF曾在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和家蚕杆状病毒中成功地表达。

重组人表皮生长因子应用方面尚有两个亟需解决的问题，即重组人表皮生长因子的产量和生物活性问题。目前，临床应用的hEGF产品有的是细胞内以融合蛋白形式表达，鉴于hEGF在胞内以包涵体形式存在，在分离中需破裂细胞，导致纯化困难、产量低；而另外一些产品虽然是分泌性表达目的蛋白，提高了产量，但其导入的信号肽为碱性磷酸酶，只能穿过细胞内膜分泌到细胞周质中，存在分离中需破裂细胞，而且生物活性降低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有重组人表皮生长因子的纯化困难、产量低和生物活性低问题，而提供重组人表皮生长因子工程菌的构建方法。

重组人表皮生长因子工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，然后合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF；二、质粒pMD-OmpA-hEGF和质粒pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-Codon plus^TM中，即完成重组人表皮生长因子工程菌的构建；其中步骤一中根据大肠杆菌偏爱密码子设重组hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。

本发明中以BL21-Codon plus^TM为宿主菌，选用分泌性表达载体pSE系列作为hEGF表达载体，同时导入信号肽OmpA序列，能同时穿过细胞内膜及外膜，使其表达为细胞外分泌性，避免了胞内以包涵体形式表达时所造成的纯化困难的弊端，且该系列载体C端含有6×His基因，所表达蛋白可利用商品化亲和层析柱快速纯化，蛋白的纯度高和生物活性高。

本发明中原核表达系统的遗传背景清楚，易于改造，工艺简单，成本低，流程短，产量高达50mg/L，获得的蛋白易于纯化，是表达外源基因的首选系统。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式重组人表皮生长因子工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列，然后合成重组OmpA-hEGF人工序列，再将重组OmpA-hEGF人工序列连接到质粒pMD上，合成出质粒pMD-OmpA-hEGF；二、质粒pMD-OmpA-hEGF和质粒pSE分别经XhoI和EcorI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建质粒pSE-OmpA-hEGF；三、将质粒pSE-OmpA-hEGF转化到大肠杆菌BL21-Codonplus^TM中，即完成重组人表皮生长因子工程菌的构建；其中步骤一中根据大肠杆菌偏爱密码子设计重组hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。