[发明专利]一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种极端嗜盐古菌中与可降解材料PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶的研究与应用。

背景技术

许多原核生物包括细菌和某些极端嗜盐古菌，在碳源过量，氮、磷、硫、氧等元素限制的培养条件下，胞内可以积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)。PHA是一类由3-羟基脂肪酸(3HA)组成的生物聚酯，主要作为碳源、能源及还原力的贮藏性物质。PHA具有与传统的石油化工塑料如聚乙烯、聚丙烯相类似的物化性质，并且它具有可完全生物降解和利用可再生资源合成的特点，被认为是一种环境友好型的“生物可降解塑料”，可以从一定程度上缓解石油塑料引起的“白色污染”问题。PHA目前已知的应用领域包括可生物降解包装材料，手术缝合线、药物释放载体、聚合物支架等医用材料以及其手性单体在药物合成过程中的应用等。

在各种PHA中，由于生产成本的限制，目前只有PHB(聚羟基丁酸酯)与PHBV(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)在细菌中实现了半商业化的生产。PHB是PHA家族中最简单、研究最透彻的成员。尽管其性质类似于热塑性塑料，但是PHB具有易碎、热稳定性不高、可塑性和机械性能较差等缺点，因而限制了它的广泛应用。与PHB相比，PHBV由于3-羟基戊酸(3-HV)单体的掺入，其性能有了很大的改进，因此具有更加广泛的应用前景。但是，用细菌来生产PHBV需要添加昂贵的丙酸、戊酸等相关底物来提供3-HV单体，而且高浓度的相关底物会抑制菌体的生长。与细菌相比，极端嗜盐古菌作为PHA的生产菌株可以在很大程度上降低其生产成本，可以在不添加有机酸等相关碳源的情况下合成PHBV，并且所合成的PHBV在性能上要优于细菌来源的PHBV。

细菌中，上述两种短链PHA的生物合成是通过β-酮硫解酶(PhaA)，β-酮酯酰-CoA还原酶(PhaB)和PHA合酶(PhaC)所催化。β-酮硫解酶与β-酮酯酰-CoA还原酶负责提供PHA合成的前体3-HB-CoA和3-HV-CoA。目前，国际上对极端嗜盐古菌PHA的研究还主要集中在发酵工艺的优化方面，而对此类微生物中PHA合成相关基因的研究相对较少，在公开报道中未见嗜古盐菌PHA合成相关的β-酮硫解酶(PhaA)的报道，更无类似于细菌中对这些相关基因通过基因工程技术进行改造，寻求性能更加优良的PHA以及实现PHA的低成本生产的报道。因此，极端嗜盐古菌中β-酮硫解酶基因的发现、及其在极端嗜盐古菌中的遗传工程技术的改造，对于极端嗜盐古菌PHA的生物工程开发具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，名称为PhaAl，来源于极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001CGMCC No.3822，蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯(PHBV)合成和/或3-羟基脂肪酸(3-HV)合成相关的由1)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中序列1由383位氨基酸残基组成。

上述蛋白的编码基因(phaA1)也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)、2)、3)或4)的所示的基因：

1)序列表中序列2自5’末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下可以与1)或2)限定的DNA分子杂交且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有90％同源性，且编码与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

其中，序列表中序列2是由2995个脱氧核苷酸组成，开放阅读框为自5′末端第955-2106位核苷酸序列，自5′末端第2104-2106位核苷酸序列为phaA1的终止密码子，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；自5′末端第914-954位核苷酸序列为所述编码基因的启动子区域，其中第924-931位核苷酸序列为启动子核心序列。