[发明专利]菠萝中性转化酶基因Ac-NI1、其编码蛋白质以及其基因克隆方法

权利要求书

1.一种菠萝中性转化酶基因Ac-NI1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

2.一种权利要求1所述菠萝中性转化酶基因Ac-NI1编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

3.一种权利要求1所述菠萝中性转化酶基因Ac-NI1的克隆方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)以获得的总RNA为模板，采用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit进行反转录获得cDNA；

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-NI1基因编码区引物：

正向引物：5’-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3’

反向引物：5’-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3’

用第一链反转录产物10μl作为PCR的模板，反应体系为：10×PCR Buffer II 2.5μl、25mM MgCl₂ 1.5μl、10mM dNTP/analog Mixture 1μl、ExTaq 0.2μl、上游引物(20μM)1μl、下游引物(20μM)1μl、再补足Rnase Free H₂O至总体积25μl；扩增程序为：85℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃总延伸10min；

(4)PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector连接，连接产物转化E.coli DH 5α感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得Ac-NI1基因。