[发明专利]菠萝中性转化酶基因Ac-NI1、其编码蛋白质以及其基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因技术，属于生物技术领域，具体涉及一种菠萝中性转化酶基因Ac-NI1、其编码蛋白质以及其基因克隆方法。

背景技术

转化酶的分子量大小在50kD至80kD之间，为单体或二聚体，可分为酸性转化酶(AI)和中性或碱性转化酶(NI)，催化如下反应：Suc+H₂O←→Fru+Glu。NI大多被认为是一种胞质酶，其最适pH值在7.0左右，也可分为可溶性的和不溶性的两种，前者分布于细胞质中，后者存在于细胞壁上(Lowell和Tomlinson，1989；Klann等，1996；Xu等，1995)。在L.esculentum番茄果实液泡中有高活性的Ivr，所以液泡中积累了大量的果糖和葡萄糖，蔗糖的含量很少。在L.perur和L.chmielewskii番茄果实中液泡Ivr活性极低，所以在液泡中大量积累蔗糖，而果糖和葡萄糖的含量很少(D’Aoust等，1999)。近年来研究表明，在苹果(赵智中等，2001)、温州蜜柑(Beurter，1985)果实的发育早期蔗糖积累受Ivr影响较大，幼果内蔗糖的积累与Ivr的活性呈显著负相关。‘纽荷尔’脐橙幼果中转化酶对糖的积累影响较大(王利芬等，2004)。宁夏枸杞果实发育过程中，蔗糖的含量与3种代谢酶均无显著相关性，己糖的积累与转化酶活性呈现极显著的正相关，SS和SPS与这几种糖均不存在显著的相关性(郑国琦等，2008)。杨梅果实发育期间中，转化酶的变化与蔗糖积累呈负相关(谢鸣等，2005)。可见，Ivr是蔗糖在这些果实内代谢的一个关键酶。

目前已从葡萄、桃、樱桃、苹果、草莓、甘蔗、柑橘、甜瓜等作物中克隆到相应的转化酶基因。在模式植物拟南芥中已分离出9个编码NI的基因(The Arabidopsis Genome Initiative2000)；在水稻中已分离出8个基因编码NI的基因(International Rice Genome Sequencing Project2005)。从胡萝卜中克隆的NI的N-端无信号肽，富含半胱氨酸，且与AI的同源性很低(Lee和Sturm，1996)。从桃中分离出的编码NI基因的cDNA，命名为PpNI1，长为1578bp，与胡萝卜中的NI基因的同源性高达84％的，含有NI基因典型的高保守盒，属于NI基因家族的α亚族(Nonis等，2007)。在甘蔗中分离出的编码NI的SNI基因片段，含有1.7kb的开放阅读框，编码572个氨基酸，分子量约为64.3kDa，等电点为8.57(Bosch等，2004)。从甜菜中分离NI的编码基因BVInv-N，含有特有的开放阅读框，编码617个氨基酸，分子量为69.5KDa，等电点为6.84，在这个基因两端有两个特殊区域，5′具有长为197bp的非编码区，而在3′除含有439bp的非编码区还有一个poly-A尾巴(Maria-Cruz等，2007)。

转化酶基因的表达也呈现时空特异性。目前在桃、葡萄、日本梨、胡萝卜、甘蔗的等作物中已有许多转化酶基因的相关报道，但在菠萝上未发现相关研究报道。为此，对菠萝中性转化酶基因的克隆以及在不同发育时期的表达进行研究，将有助于弄清菠萝果实糖积累的分子机理，同时获得可应用于菠萝果实品质改良的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菠萝果实中性转化酶基因Ac-NI1的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1，含1034bp。

本发明的另一个目的在于提供一种菠萝果实中性转化酶基因Ac-NI1编码的蛋白序列，含345个氨基酸残基，含有植物中性转化酶结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

同时，本发明还提供该中性转化酶基因Ac-NI1的克隆方法。

本发明所提供的中性转化酶基因，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-NI1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

上述菠萝果实中性转化酶基因Ac-NI1编码的蛋白质，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-NI1蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

上述菠萝果实中性转化酶基因Ac-NI1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)以获得的总RNA为模板，采用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit进行反转录获得cDNA；

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计菠萝Ac-NI1基因编码区引物：