[发明专利]磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备方法，包括下列步骤：

①固定化载体磁性壳聚糖微球的制备

i、Fe₃O₄磁核的制备

将0.4-1.0mol/L的FeCl₂溶液和0.4-1.0mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，其中FeCl₂与FeCl₃溶液的体积比为2∶4至4∶10，加入聚乙二醇4000，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到5wt％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0，继续搅拌20-40min后，超声10-20min，70-90℃水浴熟化20-40min，再次超声10-20min使溶液体系均匀细腻，最后在磁铁的吸附下倾去上清液，重蒸水洗涤至中性，真空冷冻干燥Fe₃O₄磁核；

ii、磁性壳聚糖复合微球的制备

壳聚糖溶解在5wt％的乙酸溶液中得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，后加入步骤①i的Fe₃O₄磁核并混合均匀，其中壳聚糖与Fe₃O₄磁核重量比为1∶1至3∶1，缓慢搅拌下逐滴滴入到乳化剂失水山梨醇单油酸酯和液体石蜡组成的混合体系中，乳化剂与液体石蜡体积比为5∶80，电动搅拌10-25min后迅速滴入10wt％的戊二醛溶液，其中戊二醛与乳化剂体积比1∶1，继续在1500r/min下搅拌1-3h，最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球；

②磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备

取步骤①的冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液浸润约20-30h，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液，于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入pH4.0-12的海洋碱性蛋白酶溶液，其中海洋碱性蛋白酶量与载体的比例为0.1-0.5g酶/g载体，在温度5-45℃下震荡吸附1-2h，4℃静置2h，加入戊二醛使达到终浓度0.025-0.7重量％后在5-45℃温度下震荡交联0.5-18h，制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶，低温保存。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所述步骤②海洋碱性蛋白酶与载体的比例为0.3g酶/g载体；固定化温度15℃；固定化pH为10.0；戊二醛终浓度为0.1wt％；交联时间2h。