[发明专利]磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备方法

说明书

背景技术

本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法。 

碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，主要来源于嗜碱微生物，可催化蛋白质水解为小肽和氨基酸，广泛应用于洗涤、食品、皮革和丝绸行业，在医药、环保、化工及基础研究中也显示了广阔的应用前景。海洋碱性蛋白酶894是我实验室应用我国海洋微生物代谢产物，通过现代生物工程手段开发出的一种新型海洋酶，研究表明该酶活性高、贮藏稳定，并有良好的配伍性，在食品、纺织、饲料上有着广泛的用途。 

海洋微生物为适应海洋这一生命极限环境，海洋微生物酶表现了比陆源性微生物酶更为独特的酶学性质与生理功能。然而，由于游离酶的成本、高效性与稳定性等存在一定问题，其应用仍然面临诸多困难。因此对于现代工业来说，游离酶在使用中难以满足用户要求，不是一种理想的酶。为了克服其缺点，采用固定化海洋微生物酶技术，不仅能保持原酶的特性，而且将会大大提高酶的稳定性，可以连续长期使用而不易失活，也易与产物的分离，利于酶的重复多次使用及产品的纯化，从而显著降低酶的使用成本，因此具有更为广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在不足，为了进一步提高其使用效率，降低使用和生产成本，得到使用性稳定、活性回收高、使用周期长的固定化酶，在长期开发的海洋微生物及其酶的基础上开发提供一种磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法。 

本发明提供的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法，包括下列步骤： 

①固定化载体磁性壳聚糖微球的制备 

i、Fe₃O₄磁核的制备 

将0.4-1.0，优选0.5mol/L的FeCl₂溶液和0.4-1.0，优选0.5mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，其中FeCl₂与FeCl₃溶液的体积比为2∶4至4∶10，优选为3∶5，加入聚 乙二醇4000(PEG4000，其分子量为4000)，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到5wt％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0，继续搅拌20-40，优选30min后，超声10-20min，70-90℃，优选80℃水浴熟化20-40min，优选30min，再次超声10-20min使溶液体系均匀细腻，最后在磁铁的吸附下倾去上清液，即含有上述溶液体系容器放置于磁铁的磁场内，重蒸水洗涤至中性，真空冷冻干燥Fe₃O₄磁核。 

ii、磁性壳聚糖复合微球的制备 

壳聚糖溶解在5wt％的乙酸溶液中使得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，然后加入步骤①i的Fe₃O₄磁核并混合均匀，其中壳聚糖与Fe₃O₄磁核重量比为1∶1至3∶1，优选1∶1至2∶1，缓慢搅拌下逐滴滴入到乳化剂Span-80(失水山梨醇单油酸酯)和液体石蜡组成的混合体系中，乳化剂与液体石蜡体积比为5∶80，电动搅拌10-25min后迅速滴入10wt％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与乳化剂体积比1∶1，继续在1500r/min下搅拌1-3h，优选2h。最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水(经过两次蒸馏的离子水，简称重蒸水)反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球。 

②磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备 

取步骤①的冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液(市售或自配制)浸润约20-30h，优选24h，只要缓冲液能使微球浸润即可，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液，于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入pH4.0-12，优选8-12，更优选为10的海洋碱性蛋白酶894溶液，其中海洋碱性蛋白酶894量与载体的比例为0.1-0.5g酶/g载体，优选为0.3g酶/g载体，在温度5-45℃，优选为5-15℃下震荡吸附1-2h，优选1h，4℃静置2h，加入戊二醛使达到终浓度0.025-0.7，优选0.1重量％后在5-45℃，优选5-15℃温度下震荡交联0.5-18h，优选为2h，制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894，低温保存。