[发明专利]一种新型链霉菌分泌表达质粒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体而言，涉及一种链霉菌分泌表达质粒，以及其在链霉菌中分泌表达外源蛋白的应用。

背景技术

链霉菌是一种丝状革兰氏阳性细菌，能产生大量的次级代谢产物，如抗生素、免疫抑制剂等，在医药和农业生产中具有重要的价值。链霉菌表达体系是从20世纪中后期发展起来的一种新的原核表达体系，具有高效的蛋白分泌机制，并且表达的蛋白通常是可溶性、具有生物活性的，这些优点使其成为一种非常有前景的表达体系。

模式菌天蓝色链霉菌的基因组测序已经完成，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)也已成为一个高效分泌异源蛋白的表达宿主，许多真核蛋白在该系统中获得了成功的分泌表达，如TNFα、鲑鱼降钙素(Vrancken K，Ann éJ，Secretory production of recombinantproteins by Streptomyces，Future Microbiology，2009，4(2)：181-188)等。

到目前为止根据不同的需要已经在链霉菌中构建了大量的质粒载体(Kieser T，Bibb MJ，Buttner MJ，Chater KF，Hopwood DA：PracticalStreptomyces Genitics，2000)，其中大部分是从变铅青链霉菌ISP5434质粒pIJ101衍生而来。虽然链霉菌的克隆表达体系已逐渐完善，但是向链霉菌中直接引入外源基因仍然比大肠杆菌复杂，并且能达到大肠杆菌表达水平的载体还很少。

研究人员在1992年从力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)中分离出一种新质粒pSGL1(李晓平，李元，中国抗生素杂志，1992，17(5)：326～332)，该质粒具有易于分离，分子量小(7.4kb)和带有多个限制性酶切位点的特点。进一步的研究表明，pSGL1为高拷贝质粒，其最小复制子位于Sau3AI酶切的2.0kb片段上(洪斌，李元，球孢链霉菌质粒pSGL1的性质研究，微生物学报，1998，38(4)：256-260；张华，洪斌，李元，链霉菌质粒pSGL1最小复制子序列测定及分析，微生物学报，1999，39(4)：327-332)，而且该质粒与常用的pIJ101衍生质粒相容，可用于异源基因的克隆和表达。但是该质粒现在还没有充分优化，不含大肠杆菌质粒复制子和接合转移元件oriT，只能采用原生质体转化的方式来进行链霉菌中外源基因的克隆，操作比较繁琐；没有方便实用的多克隆位点来克隆需要表达的外源基因；没有外源基因表达必需的启动子；没有外源基因分泌表达必需的信号肽。因此尚需要进一步开发简便易用、表达效率高的链霉菌表达载体。

发明内容

基于此需要，发明人进行了多方面的研究，选择了力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027中的表达元件，由此构建了能在链霉菌中进行重组蛋白表达的新型载体。

本发明的一个方面涉及一种表达载体，其为环状，且可操作地连接有：

源于pSGL1的复制子序列：其由SEQ ID NO：1中第5086-7372位所示序列的互补序列构成；

大肠杆菌复制起始区ori序列：其由SEQ ID NO：1中第2497-3164位所示序列构成；

氨苄青霉素抗性基因bla序列：其由SEQ ID NO：1中第3315-4172位所示序列的互补序列构成；

多克隆酶切位点序列：其由SEQ ID NO：1中第1452-1481位所示序列构成；

阿普霉素抗性基因aac(3)IV序列：其由SEQ ID NO：1中第204-980位所示序列的构成；

源于链霉菌接合转移的必需区oriT序列：其由SEQ ID NO：1中第8602-8713位所示序列构成；

cagAp和ermE*p串联的强启动子序列：其由SEQ ID NO：1中第1581-2057位所示序列的互补序列构成；和

信号肽序列：其由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列的互补序列构成或者由SEQ ID NO：1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替换为TTA的互补序列构成。

本发明另一方面涉及一种表达载体，其为环状，且由SEQ ID NO：1所示序列构成。