[发明专利]一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种猪新基因BCL-G_L多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：猪BCL-G_L基因的克隆；A2：原核表达载体pET32a-BCL-G_L的构建；A3：真核表达载体pEGFP-BCL-C_L的构建；A4：BCL-G_L蛋白的原核表达；A5：BCL-G_L蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-G_L多克隆抗体的制备。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A1具体执行以下操作：以人BCL-C_L基因cDNA序列为种子序列，在GenBank中对猪的ESTs数据库进行BLAST比对拼接，得到猪的BCL-G_L基因的cDNA序列；以所述cDNA序列为参照，设计上游克隆引物P1：SEQ ID NO：1，下游克隆引物P2：SEQ ID NO：2；取1日龄大约克夏猪脾脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA；以所述总cDNA为模板，进行PCR，同时用猪β-actin作为PCR内参；扩增得到目的序列；回收所述目的序列，连接到pMD19-T载体得到重组质粒pMD19-BCL-G_L，转化到DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落，提取质粒，经过双酶切鉴定后送测序公司进行测序。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述25μL PCR反应体系为：Premix Taq酶12.5μL，cDNA 1.25μL，引物P10.5μL，引物P20.5μL，ddH₂O 10.25μL；所述PCR参数为95℃ 5min，然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A2执行以下操作：根据所述pMD19-BCL-G_L载体测序结果，设计原核表达引物，上游原核表达引物P3：SEQ IDNO：3，下游原核表达引物P4：SEQ ID NO：4；以所述总cDNA为模板，用上、下游原核表达引物进行PCR扩增得到目的序列；将所述目的序列和pET32-a载体进行BamH I和HindIII双酶切3h；进行电泳检测和凝胶回收；将回收产物用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；将连接产物转化到DH5α感受态细胞；经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取质粒进行BamHI和Hind III双酶切鉴定，重组质粒命名为pET32a-BCL-G_L；然后将重组表达质粒转化到BL21感受态细胞，经双酶切鉴定后，由测序公司进行测序。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述25μLPCR反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，模板1.25μL，引物P30.5μL，引物P40.5μL，ddH₂O10.25μL；所述PCR反应参数为95℃ 5min，然后94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A3中真核表达载体的构建过程中，上游引物P5：SEQ ID NO：5，下游引物P6：SEQ ID NO：6；所用表达载体为pEGFP-C1，重组质粒命名为pEGFP-BCL-G_L。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A4中，所述BCL-G_L蛋白的原核表达方法为：将转化有重组表达质粒pET32a-BCL-G_L的BL21菌，接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜；次日，以1％的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，扩大培养2h后，用终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导，于24℃在180r/min摇转培养7h；取菌液进行超声波裂解，离心后分别取上清和沉淀制备蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE分析。