[发明专利]一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法无效
| 申请号： | 201010198346.9 | 申请日： | 2010-06-12 |
| 公开（公告）号： | CN101962644A | 公开（公告）日： | 2011-02-02 |
| 发明（设计）人： | 蒋朋飞;张德礼 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/63;C07K14/47;C07K16/18;C07K16/06 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 712100 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种猪 基因 bcl sub 克隆 抗体 制备 方法 | ||
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及的是一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法。
背景技术
细胞凋亡(apoptosis)也称为“程序性细胞死亡”或“细胞自杀”，近年来大量的研究工作揭示细胞凋亡与细胞增殖和分化具有同样重要的意义。对免疫系统而言，细胞凋亡不仅是免疫系统发育过程中必不可少的一个环节，而且是免疫系统行使功能的一种方式。越来越多的研究资料表明，细胞凋亡与肿瘤发生、病毒感染细胞的清除等有密切关系，因而对细胞凋亡的研究对肿瘤、病毒病等疾病的治疗也有很大意义。细胞凋亡的发生和调控涉及到多个基因家族，其中BCL2基因家族就是一个与凋亡密切相关的基因家族，该家族成员对细胞凋亡与否起关键作用，已知BCL-G是近年来在人类、小鼠和牛等物种发现的BCL2家族的成员之一，其可变剪接体BCL-Gs和BCL-GL均为促细胞凋亡因子。而在猪体内是否含有类似的基因，还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：A1：猪BCL-GL基因的克隆；A2：原核表达载体pET32a-BCL-GL的构建；A3：真核表达载体pEGFP-BCL-GL的构建；A4：BCL-GL蛋白的原核表达；A5：BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备。所述的方法，所述A1具体执行以下操作：以人BCL-GL基因cDNA序列为种子序列，在GenBank中对猪的ESTs数据库进行BLAST比对拼接，得到猪的BCL-GL基因的cDNA序列；以所述cDNA序列为参照，设计上游克隆引物P1：SEQ ID NO：1，下游克隆引物P2：SEQ ID
NO：2；取1日龄大约克夏猪脾脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA；以所述总cDNA为模板，进行PCR，同时用猪β-actin作为PCR内参；扩增得到目的序列；回收所述目的序列，连接到pMD19-T载体得到重组质粒pMD19-BCL-GL，转化到DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落，提取质粒，经过双酶切鉴定后送测序公司进行测序。
所述的制备方法，所述25μL PCR反应体系为：Premix Taq酶12.5μL，cDNA 1.25μL，引物P10.5μL，引物P20.5μL，ddH2O 10.25μL；所述PCR参数为95℃5min，然后94℃1min，53℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
所述的制备方法，所述步骤A2执行以下操作：根据所述pMD19-BCL-GL载体测序结果，设计原核表达引物，上游原核表达引物P3：SEQ ID NO：3，下游原核表达引物P4：SEQID NO：4；以所述总cDNA为模板，用上、下游原核表达引物进行PCR扩增得到目的序列；将所述目的序列和pET32-a载体进行BamH I和Hind III双酶切3h；进行电泳检测和凝胶回收；将回收产物用T4DNA连接酶于16℃连接过夜；将连接产物转化到DH5α感受态细胞；经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取质粒进行BamH I和Hind III双酶切鉴定，重组质粒命名为pET32a-BCL-GL；然后将重组表达质粒转化到BL21感受态细胞，经双酶切鉴定后，由测序公司进行测序。
所述的制备方法，所述25μLPCR反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，模板1.25μL，引物P30.5μL，引物P40.5μL，ddH2O 10.25μL；所述PCR反应参数为95℃5min，然后94℃1min，60℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
所述的制备方法，所述步骤A3中真核表达载体的构建过程中，上游引物P5：SEQ IDNO：5，下游引物P6：SEQ ID NO：6；所用表达载体为pEGFP-C1，重组质粒命名为pEGFP-BCL-GL。
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