[发明专利]猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养方法

权利要求书

1.一种猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

(1)取5-10克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30～60分钟；

(2)收集上清液中的细胞，用DMEM洗三次后以1200转/分速度离心5分钟；

(3)将收集到的细胞置于10％胎牛血清DMEM的密封离心管中悬浮培养，以形成细胞团块；

(4)挑出单个的细胞团块，接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板；

(5)细胞培养液含有10mmol/L nicotinami de，1x I TS，100U/mlpenicillin，100μg/ml streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生长因子EGF，10ng/ml肝细胞生长因子HGF；

(6)待细胞在培养板上长满后，用t ryps in-EDTA在37℃消化10～30分钟，用流式细胞术分选E-cad+细胞，收集猕猴成体肝脏前体细胞。

2.根据权利要求1所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是细胞培养条件为37℃，5％的CO₂，每两天换一次培养液。

3.根据权利要求1或2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步骤(1)在37℃的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30分钟。

4.根据权利要求1或2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步骤(3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37℃的摇床中悬浮培养。

5.根据权利要求3所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步骤(3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37℃的摇床中悬浮培养。

6.根据权利要求1、2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培养，可按1∶2或1∶3多次传代。

7.根据权利要求3所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培养，可按1∶2或1∶3多次传代。

8.根据权利要求4所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培养，可按1∶2或1∶3多次传代。

9.根据权利要求5所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培养，可按1∶2或1∶3多次传代。

10.根据权利要求6所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培养，可按1∶2或1∶3多次传代。