[发明专利]猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养方法

说明书

技术领域

本发明属于动物前体细胞分离及培养液，特别是猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养液。

背景技术

我国现有慢性肝炎病人3000万，其中一部分逐步发展成为肝纤维化，肝纤维化如果进一步恶化将导致肝硬化、肝衰竭、门静脉高压等。一般说来，早期肝纤维化是可逆的，而晚期肝纤维化即肝硬化则是不可逆的，器官移植是目前治疗晚期肝脏疾病唯一可行方案，然而，供体器官严重缺乏限制了其应用。

越来越多的研究表明：以肝干(前体)细胞为基础的细胞替代治疗已成为治疗肝脏疾病新的希望。成体肝脏前体细胞(Hepatic Progenitor cells，HPCs)具有较强的细胞增殖及分化为特定细胞类型的能力，较低的畸胎瘤生成率，而没有胎儿来源的HPCs和胚胎干细胞存在的伦理问题，因此被认为是细胞替代治疗晚期肝脏疾病的理想种源细胞。

目前已分离到多种类型的成体HPCs。来源于人、小鼠和大鼠病理肝脏中的卵圆细胞(oval cells)是最早被鉴定具有HPCs功能的细胞，卵圆细胞在体内外具有很强的增殖能力，并能分化为肝细胞或胆管上皮细胞(biliaryepithelial cells，BECs)的能力。但由于细胞分离是一种甚为复杂的技术，要做到最大限度的富集所需的细胞，同时减少其他细胞的百分比，要求细胞分离培养的每一个环节都要经过比较分析，才能得到一个简单、高效、稳定的体系。目前还没有从正常的成体肝脏中得到与卵圆细胞相同表型一致细胞的报道。成熟的肝细胞由于在体外可以分化为胆管上皮细胞或表达胆管上皮细胞的相关蛋白，并可参与再生胆管的重塑，因此也被认为是成体HPCs细胞中的一种，遗憾的是成熟的肝细胞在体外很难扩增培养。

除了卵圆细胞和肝细胞外，来源于小鼠、大鼠和猪健康的成体肝上皮细胞(liver epithelial progenitor cells，LEPCs)具有HPC的特性，这些上皮细胞呈现干细胞特有的扩增能力、并能分化为肝脏特定的细胞类型，移植后可恢复受损肝脏的肝功能水平，所有这些特性表明：肝脏上皮前体细胞是潜在的细胞替代治疗理想的供体细胞。同样，从啮齿类，人以及SV40T转染的食蟹猴的胎儿肝脏也可分离到类似的肝脏上皮细胞。

许多研究进行了从人的成体肝脏中分离HPCs的尝试。利用特定的培养条件可从正在进行肝切除的病人的肝内分离到一种能在体外长期增殖的肝干细胞(human hepatic stem cells，HHSC)。然而，该细胞群的表达模式以及分化潜力都表明它们更加类似于间充质干细胞(mensenchymal stem cells，MSCs)而不是传统意义上的HPCs。最近，从人健康的成体或肝切除的肝脏中得到了呈现肝胆表达模式的肝上皮细胞，提示它们可能是潜在的前体细胞。但目前报道并没有完全证实肝脏前体细胞的特性，如细胞的双向(肝和胆)分化能力。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可应用于猕猴成体肝脏前体细胞的分离培养方法，所分离得到的细胞能够为灵长类各个物种的成体肝脏前体细胞的分离培养和细胞分化机制的研究，尤其是作为替代治疗晚期肝脏疾病的理想种源细胞奠定基础。

本发明目的通过以下步骤实现：

(1)取5-10克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30～60分钟；

(2)收集上清液中的细胞，用DMEM洗三次后以1200转/分速度离心5分钟；

(3)将收集到的细胞置于10％胎牛血清DMEM的密封离心管中悬浮培养，以形成细胞团块；

(4)挑出单个的细胞团块，接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板；

(5)细胞培养液含有10mmol/L nicotinamide，1x ITS，100U/mlpenicillin，100μg/ml streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生长因子EGF，10ng/ml肝细胞生长因子HGF；

(6)待细胞在培养板上长满后，用trypsin-EDTA在37℃消化10～30分钟，用流式细胞术分选E-cad+细胞，收集猕猴成体肝脏前体细胞。

所述的细胞培养条件为37℃，5％的CO₂，每两天换一次培养液。

所述步骤(1)在37℃的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30分钟。

所述步骤(3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37℃的摇床中悬浮培养，