[发明专利]一种重组人胰激肽原酶

权利要求书

1.一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为35.0-44.0KDa，其一级结构为：

2.根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶，该分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。

3.制备根据权利要求1所述的重组人胰激肽原酶的方法，其步骤为：

1)根据KLK1的DNA序列设计引物，采用RT-PCR方法从人胰腺扩增KLK1 DNA序列；

2)将KLK1 DNA克隆到表达载体，构建含有KLK1 DNA的表达质粒；

3)将含有KLK1 DNA表达质粒转入宿主细胞；

4)用发酵方法或大规模细胞培养方法大量生产表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，其步骤如下：

a)将含有表达重组蛋白的细胞株用含有5-10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，然后在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，小规模悬浮批次培养，置温度37℃、5％CO₂培养箱内孵育生长，接种于细胞培养罐中进行细胞连续培养，接种密度为1.0×10⁵/ml-5.0×10⁵/ml，培养温度37℃、pH7.2、转速50-120rpm/min，溶解氧50％空气饱和度和通气量0.1Lpm；

b)在无血清培养基中培养24-72小时后，将无血清培养基灌注进入生物反应器进行灌注培养，保持残糖量在0.8-1.2g/L；

c)收集含有表达重组人胰激肽原酶的培养基，过滤去除细胞碎片，上清液用于重组蛋白的纯化；

5)从大量培养的表达重组人胰激肽原酶的细胞中纯化重组蛋白，该蛋白的纯化包括以下步骤：

a)将含有重组人胰激肽原酶的培养基超滤浓缩后，上扩张床强阴离子交换柱，冲洗柱子至OD₂₈₀＜0.2；用缓冲液洗脱柱子；

b)在上述洗脱收集液加入(NH₄)₂SO₄，用HCl调整pH 7.0±0.1上苯基交联琼脂糖快速流凝胶，洗脱液用10000MWCO膜超滤至3L，加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时，加热后将溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶柱，冲洗，洗脱。

c)调节上述洗脱收集液pH4.0±0.1，上SP琼脂糖凝胶FF柱，冲洗至流出液OD280＜0.15，洗脱，收集OD280＞0.1的洗脱流出液，将洗脱收集液调pH7.0，用10000MWCO膜进行超滤浓缩，得到纯化的重组人胰激肽原酶蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤1)中的KLK1DNA序列包括cDNA、基因组DNA和人工合成的DNA。

5.根据权利要求4所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤2)中的表达载体包括原核表达载体、酵母表达载体或真核表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤3)中的宿主细胞包括原核细胞、酵母或哺乳细胞。

7.根据权利要求6所述的重组人胰激肽原酶的制备方法，其中步骤4)的a)中，所述的接种密度为3.0×10⁵/ml，转速为90rpm/min。

8.权利要求1-2所述的重组人胰激肽原酶在制备治疗脑梗塞的药物中的用途。