[发明专利]一种重组人胰激肽原酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组人胰激肽原酶及其新的制备方法。更具体地说，本发明涉及利用分子生物学技术获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞，用大规模细胞培养或发酵方法生产宿主细胞，从细胞中或细胞外分泌物中使用亲和层析方法提取重组人胰激肽原酶，该重组人胰激肽原酶的糖链结构组成比人尿中提取的天然蛋白更为复杂，在临床上具有多种用途，具有更小的副作用。

背景技术

人激肽原酶基因是一类大的多基因家族，至少由15个基因(KLK1-KLK15)组成。但只有胰/肾激肽原酶基因(KLK1基因)编码的蛋白具有激肽原酶活性，其它家族成员几乎都没有激肽原酶活性。人胰激肽原酶能作用于激肽原底物，使之释放出具有生物活性的激肽，激肽与靶器官上特定受体结合能产生一系列生物效应，如扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。

目前已上市的人尿来源的激肽原酶产品，即人尿激肽原酶，是从人尿中提取的糖蛋白。其氨基酸组成与人胰激肽原酶的氨基酸序列相同，但是，从人尿中提取的激肽原酶蛋白的162位点上存在Glu/Lys两种氨基酸，这种氨基酸的多态性对酶活性的影响未知。临床上使用人尿激肽原酶发现静脉滴注过快会导致患者血压急剧下降等不良副作用，给病人带来了一定风险。另外，人尿收集困难，人尿蛋白资源十分有限。其来源范围越广，成分越复杂，可能含有病毒等成分。同时欧美等高端市场普遍不接受人尿来源产品。

分子生物学技术的发展使得利用宿主细胞表达并大规模生产重组蛋白成为可能，目前利用基因表达方法生产重组蛋白已代替了传统的从自然资源中提取天然蛋白方法。对于糖蛋白，一般是将编码糖蛋白的基因转入哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，以生产与天然蛋白接近并具有生物活性的重组蛋白。

KLK1基因位于染色体19q13.4，其大小为6.55kb，编码区为874bp。KLK1全长基因编码262个氨基酸组成的激肽酶原(即前体蛋白)，包括17个氨基酸信号蛋白，7个氨基酸酶原片段和238个氨基酸成熟蛋白。激肽酶原在体内进一步被蛋白酶切割和加工成为具有生物活性的成熟人胰激肽原酶。KLK1基因在胰腺、肾脏和唾液腺表达最高。

人胰激肽原酶是一种糖蛋白，分子中含有14.4％的糖，其结构中包括三个N糖基化位点，分别位于Asn78，Asn84及Asn141。研究表明，人胰激肽原酶在CHO细胞中表达时，CHO大规模培养条件影响其糖基化程度，进而也影响到其体内的活性。因此，选择适当的CHO培养条件，制备活性相似、副作用小的人胰激肽原酶成为科研者的最新攻克难题。

发明内容

本发明通过分子生物学技术克隆KLK1基因，将该基因转入宿主细胞进行表达，并用细胞培养或发酵方法大量生产含有重组蛋白的细胞，从细胞或胞外分泌液中提取重组人胰激肽原酶。优选，利用大规模培养CHO细胞制备重组人胰激肽原酶。该重组人胰激肽原酶在临床上有多种用途，与人尿来源的激肽原酶相比活性相似、副作用小，尤其是对血压下降影响更小的特点。

本发明的一个目的是通过细胞培养或发酵方法获得一种重组人胰激肽原酶。具体说，本发明是利用分子生物学技术克隆KLK1基因并获得表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞；利用大规模细胞培养或发酵方法进行表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞的大量生产，采用亲和层析方法纯化获得重组人胰激肽原酶。

本发明的另一个目的是重组人胰激肽原酶用于制备治疗脑梗塞的药物的用途。

优选，表达重组人胰激肽原酶的宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，该宿主细胞的大规模培养采用灌注反应器进行灌注培养。通过优化培养条件提高了细胞生长密度和表达产物的糖基化程度。

本发明提供了一种重组人胰激肽原酶，其中所述重组人胰激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，分子中含有5对S-S键，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为35.0-44.0KDa，其一级结构为：

所述重组人胰激肽原酶分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点约为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。